ANALYSEMETODER - Oslo universitetssykehus
ANALYSEMETODER - Oslo universitetssykehus
ANALYSEMETODER - Oslo universitetssykehus
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
<strong>ANALYSEMETODER</strong><br />
Immunoassay<br />
ANALYSEPRINSIPP<br />
En immunoassay er en kvantitativ målemetode som baserer seg på reaksjonen<br />
mellom et antigen og ett eller flere spesifikke antistoffer. Metoden er følgelig<br />
avhengig av gjenkjennelsesreaksjonen mellom antistoff og de respektive<br />
determinante immunogene seter på antigenet. Analyser basert på immunoassayprinsippet<br />
kan deles inn i to hovedgrupper: Kompetitive assays (reagens<br />
underskuddsassays) og non-kompetitive assays (reagens overskuddsassays).<br />
Kompetitive assays<br />
De kompetitive assays benytter seg av at reaksjonen mellom antigenet (analytten)<br />
som skal kvantiteres, og det spesifikke antistoffet er reversibel. Metoden består i at<br />
en blanding bestående av en konstant mengde merket antigen og antistoff inkuberes,<br />
det siste i underskudd, og en variabel mengde umerket antigen til stede i standarder<br />
eller ukjent prøve. Under inkuberingen vil det da oppstå en "konkurranse" mellom<br />
merket og umerket antigen om det begrensede antall antistoff-bindingsseter.<br />
Bindingen av merket antigen til antistoff vil følgelig være omvendt proporsjonal med<br />
mengden umerket antigen til stede.<br />
Etter endt inkubering er det nødvendig å skille bundet og ubundet merket reagens<br />
(antigen) for at det såkalte responssignalet skal kunne måles. På grunnlag av det<br />
registrerte responssignalet (fritt eller bundet merket antigen) i de respektive<br />
standarder konstrueres en standardkurve, og på grunnlag av det registrerte<br />
responssignalet i de ukjente prøver, kan mengde antigen (analytt) beregnes.<br />
I prinsippet anvendes to forskjellige separasjonsprosedyrer. Den ene baserer seg på<br />
isolasjon av fritt merket antigen, mens den andre baserer seg på isolasjon av merket<br />
antigen-antistoff-kompleks. Av de to metodene er den siste mer "robust" enn den<br />
første. Årsaken til dette er at når fritt antigen isoleres (adsorberes), vil det dannede<br />
antigen-antistoff-kompleks begynne å dissosiere. Dersom separasjonstiden ikke er<br />
like lang for alle prøver, vil graden av dissosiasjon være forskjellig, særlig dersom<br />
dissosiasjonshastigheten er høy. De fleste moderne kompetitive immunoassays<br />
baserer seg derfor på isolasjon av merket antigen-antistoffkompleks, enten ved at<br />
primær-antistoff eller et sekundær-antistoff er bundet til en fast fase (for eksempel en<br />
brønn i en mikrotiterplate).<br />
I og med at det benyttes kun en epitop på Analytten og et antistoff, kan kompetitive<br />
immunoassays benyttes til bestemmelse av både små (tyroksin) og store<br />
(proteinhormoner) analytter.<br />
Non-kompetitive assays<br />
Når det gjelder de non-kompetitive immunoassays, baserer disse seg på at det<br />
benyttes to forskjellige antistoffer rettet mot to forskjellige epitoper på det antigenet<br />
(analytten) som skal kvantiteres. Det ene antistoffet er som regel immobilisert
(bundet til en fast fase), mens det andre er bærer av et eller annet egnet merkestoff,<br />
og fungerer derved som "merkelapp". De to anvendte antistoffene benyttes i<br />
overskudd, slik at all tilgjengelig analytt i de respektive inkubater bindes til det<br />
immobiliserte antistoffet under inkubering. Det merkede antistoffet vil også bindes til<br />
de samme analyttmolekyler, og mengden bundet merket antistoff vil derfor direkte<br />
gjenspeile mengden analytt til stede.<br />
På samme måte som ved de kompetitive assays, er det nødvendig å skille bundet og<br />
ubundet merket reagens (antistoff) etter endt inkubering for at responssignalet skal<br />
kunne registreres. Som nevnt vil de non-kompetitive assays nesten alltid operere<br />
med det ene antistoffet koblet til en fast fase, og kalles derfor ofte for "two-site<br />
immunometric sandwich" assays.<br />
I og med at det benyttes to eptioper på analytten og to antistoffer, kan denne type<br />
immunoassay bare benyttes til bestemmelse av anlytter som er store nok til å<br />
inneholde to uavhengige epitoper.<br />
Homogene immunoassays<br />
Kravet om stadig hurtigere analysesvar, sammen med behovet for forenklede analyser,<br />
har ført til en økende etterspørsel etter de såkalte "non-separation" assays.<br />
Dette er analyser der det ikke må skilles mellom fritt og bundet merket reagens for<br />
måling av responssignalet (homogene assays). Metoden er basert på at<br />
merkestoffets egenskaper er forskjellige i fri og bunden form.<br />
MERKESTOFFER<br />
De non-kompetitive metoder er langt mere sensitive og spesifikke enn de tidligere<br />
kompetitive assays. Dette skyldes i vesentlig grad anvendelsen av monoklonale<br />
antistoffer og innføringen av nye typer merkestoffer med langt høyere spesifikk<br />
aktivitet enn det man kunne oppnå ved merking med radioaktivitet.<br />
I de første kompetitive assays ble det utelukkende benyttet radioaktivitet som<br />
merkelapp. Etter hvert ble det også introdusert andre merkestoffer som f.eks.<br />
merking med enzym, og fluorescerende prober som fluorescin-isotiocyanat. Kravet<br />
om mer og mer sensitive immunometriske metoder, behovet for en økende grad av<br />
rasjonalisering, kravet om økt holdbarhet av merket reagens og strengere rutiner i<br />
forbindelse med kast og arbeid med radioaktive substanser har ført til en stadig<br />
søken etter nye merkestoffer og innføring av såkalte "black box " instrumenter. Nye<br />
merkestoffer som luminol og akridin-estere (chemiluminiscence), og lanthanidchelater<br />
(time-resolved fluorescense) har på grunn av dette sett dagens lys.<br />
BEREGNING AV RESULTATER<br />
Ved de fleste kompetitive og non-kompetitive assays må som nevnt merket fritt<br />
reagens separeres fra merket bundet reagens før måling av responssignalet<br />
(heterogene assays). Siden det i dag anvendes en rekke forskjellige merkestoffer<br />
med responssignaler basert på vesentlig forskjellige prinsipper, er bruk av spesielle
instrumenter til disse endepunktsmålinger i stadig større grad nødvendig.<br />
Uansett type måleinstrument er kravet i dag at utstyret er tilkoplet en datamaskin som<br />
både kan konstruere en standardkurve, beregne resultater, overføre svar til en "main<br />
frame" datamaskin og produsere relevante kvalitetskontrolldata. Til konstruksjon av<br />
standardkurven brukes det følgende tre metoder i forbindelse med denne funksjonen:<br />
• Dataprogram som baserer seg på den teoretiske modellikning som gjelder for<br />
reaksjon mellom antigen og antistoff.<br />
• Dataprogram som baserer seg på en matematisk empirisk kurvetilpasning.<br />
• Program som baserer seg på forskjellige interpolasjonsteknikker.<br />
KVALITETSVURDERING<br />
Før Hormonlaboratoriet tar i bruk en ny immunoassaymetode, enten basert på egne<br />
reagenser (in-house-metode) eller på et kommersielt testkit, blir blant annet følgende<br />
kvalitetsparametere bestemt (metodevalidering):<br />
• Metodens måleområde (dynamic range).<br />
• Metodens spesifisitet, det vil si en undersøkelse over hvordan nær beslektede<br />
substanser påvirker analysen.<br />
• Metodens deteksjonsgrense (analytisk sensitivitet), det vil si gjentatte målinger<br />
av prøver som ikke inneholder analytten som skal måles (nullprøver), og deretter<br />
bestemmelse av analyttkonsentrasjonen som gir en respons tilsvarende mean<br />
respons i nullprøven pluss 2,5 x standard avvik.<br />
• Metodens kvantifiseringsgrense (funksjonell sensitivitet), det vil si bestemmelse<br />
av den laveste analyttkonsentrasjonen som gir en CV
Det benyttes også referanseområder som er bestemt av leverandøren av metoden<br />
eller fra publisert materiale. I slike tilfeller bekreftes referanseområdene med minst 20<br />
prøver fra en av gruppene som nevnt ovenfor.<br />
KVALITETSSIKRING<br />
For å sikre høy kvalitet på de daglige rutineanalyser er det nødvendig å ha<br />
implementert et adekvat kvalitetssikringsprogram (QA). Et av elementene i<br />
forbindelse med kvalitetssikringen er anvendelsen av interne kvalitetskontroller (IQ).<br />
På Hormonlaboratoriet ble det laget egne interne kvalitetskontroller til dette bruk,<br />
basert på serum fra normale blodgivere. Kontroller på tre nivåer anvendes. Disse er<br />
laget ved hensiktsmessig blanding av serum fra forskjellige blodgivere og evt.<br />
"spiking" med rene hormonpreparater.<br />
Internkontroller medanalyseres i hver serie, og verdiene føres på et eget kontrollark<br />
(Shewart plot). Hormonlaboratoriet benytter et et spesielt EDB-program for<br />
resultatberegning og kvalitetskontroll (Multicalc fra Perkinelmer - Wallac Oy, Finland).<br />
Dette benyttes til alle de manuelle og for en del av de automatiserte metodene.<br />
Anvendelsen av internkontroller gjør det mulig kontinuerlig å følge metodenes<br />
reproduserbarhet.<br />
Alle laboratoriets akkrediterte metoder er med i et eksternt kvaltetssikringsprogram<br />
(EQAS). I slike program får laboratoriet tilsendt ukjente prøver som settes opp som<br />
en rutineprøve. Svaret sendes til EQAS leverandøren som sender ut rapporter som<br />
viser hvordan laboratoriets prøvesvar samsvarer med de andre deltagende<br />
laboratoriene og eventuelt, med en referansemetode (LC-MS/MS for<br />
steroidhormoner).<br />
FEILKILDER<br />
Som nevnt innledningsvis baserer en immunoassay seg på en reversibel reaksjon<br />
mellom et antigen (standard eller analytt) og ett eller flere mer eller mindre spesifikke<br />
antistoffer. Hovedprinsippet ved en immunoassay er å sammenlikne<br />
immunogenisiteten til analytten som ønskes å måle og en mer eller mindre vel<br />
definert standard. Alle substanser som kan påvirke bindingen mellom analytt og<br />
antistoffet, vil følgelig kunne gi opphav til "gale" resultater. Det er derfor vanlig med<br />
mye større usikkerhet i immunoassays enn i vanlige klinisk-kjemiske analyser hvor jo<br />
en egenskap av analytten bestemmes direkte.<br />
I tabellen under er det listet opp en del faktorer som kan føre til uriktige analysesvar<br />
ved benyttelse av analyser basert på immunoassay-prinsippet.<br />
• Uspesifikt antistoff (gir opphav til kryssover)<br />
• Spesifikt monoklonalt antistoff (kan overse isoformer)<br />
• Ufullstendig separasjon av bundet og ubundet antigen<br />
• Binding av merkelapp til annet enn spesifikt antistoff (uspesifikk binding, NSB)<br />
• Substanser som kan påvirke responssignalet
• Forskjellig matrix i standardprøver og pasientprøver<br />
• Interferns i form av heterofile antistoffer eller revmatoid faktor i prøven<br />
Kromatografi<br />
GENERELT<br />
Kromatografiske metoder brukes ved Hormonlaboratoriet til analyse av adrenalin,<br />
noradrenalin og vanilinmandelsyre i urin, 25-hydroksy-vitamin D i serum, forskning<br />
(proteomikk, metabolomikk) og som referanse for immunologiske metoder.<br />
ANALYSEPRINSIPP 1<br />
Kromatografi er en separasjonsmetode basert på to ikke blandbare faser. Den ene<br />
fasen er mobil og den andre stasjonær. En prøve blir injisert i den mobile fasen og<br />
transportert gjennom en kolonne langs den stasjonære fasen. De ulike stoffer<br />
fordeler seg mellom eller vekselvirker med de to fasene i forskjellig grad og<br />
separeres dermed. Vanlige kromatografimetoder er:<br />
<br />
Væskekromatografi (Liquid Chromatography, LC)<br />
o Den mobile fasen er en væske<br />
o Den stasjonære fasen er et fast stoff<br />
<br />
Gasskromatografi (GC)<br />
o Den mobile fasen er et gass<br />
o Den stasjonære fasen er en væske<br />
Ved Hormonlaboratoriet brukes LC som kromatografisk metode.<br />
Separasjonsprinsippet som er brukt er omvendt fase kromatografi, der den mobile<br />
fasen er polar, en vandig væske (vandig buffer, MeOH, acetonitril) og den stasjonære<br />
fasen er hydrofob (C 18 , PFP). Separasjonen er basert på interaksjoner mellom analytt<br />
og stasjonærfase, og de viktigste interaksjonene er van der Waal krefter (svake<br />
hydrofobe krefter) som øker med størrelsen av analytten.<br />
I omvendt fase kromatografi har polare stoffer (stoffer med mange –OH, NH3, =O<br />
grupper) minst retensjon, mens hydrofobe stoffer (stoffer med mange –CH grupper)<br />
har høyest retensjon.<br />
LC instrumentene deles inn i HPLC (High Performance LC) og UHPLC (Ultra High<br />
Performance LC). Forskjellen er partikkelstørrelsen brukt i separasjonskolonnen.<br />
Typisk partikkelstørrelse i HPLC er 3,5-10µm, mens den er 10-15 min på HPLC) og smalere topper, noe som fører til at det kan separeres
flere analytter per tidsenhet [2].<br />
DETEKSJON 3<br />
For å dra nytte av en kromatografisk separasjon må en detektor installeres ved<br />
slutten av separasjonskolonnen. Den skal gi et elektrisk signal når de forskjellige<br />
stoffer eluerer fra kolonnen. Dermed fåes en konsentrasjonsprofil (kromatogram)<br />
mot tiden.<br />
Følgende detektorer brukes ved Hormonlaboratoriet:<br />
UV (Ultra Violett absorpsjonsdetektor)<br />
o Detekterer komponenter som absorberer UV-lys.<br />
o Brukt til proteomikk/metabolomikk.<br />
Elektrokjemisk detektor<br />
o Detekterer komponenter som kan oksideres eller reduseres.<br />
o Brukt til katekolaminer (adrenalin, noradrenalin) og vanilinmandelsyre.<br />
MS (Massespektrometri)<br />
o Separasjon av ioner i gassfase basert på masse-ladningsforhold (m/z).<br />
o Brukt til 25-hydroksy-vitamin D og proteomikk/metabolomikk.<br />
For å kunne bruke MS, må analytten(e) ioniseres. De vanligste ioniseringsteknikkene<br />
for små eller mellomstore molekyler er:<br />
<br />
<br />
<br />
Elektrospray ionisering (ESI)<br />
Atmosfærisk trykk kjemisk ionisering (APCI)<br />
Atmosfærisk trykk foto ionisering (APPI)<br />
Alle ioniseringsteknikkene lager først og fremst intakte molekylioner. Videre<br />
fragmentering skjer i masseanalysatoren. ESI er den mest brukte<br />
ioniseringsteknikken og denne brukes også ved Hormonlaboratoriet. Eluenten fra LC<br />
systemet introduseres gjennom et kapillær i ionekilden, og et spray lages ved hjelp<br />
av nitrogengass og varme samtidig som det settes på en spenning. Ideelt skal<br />
analytten være ladet i mobilfasen, ellers skjer ladningsoverføring samtidig med<br />
dråpedannelsen i sprayen.<br />
Separasjon ev ionene skjer i masseanalysatoren, og her finnes det også flere typer å<br />
velge mellom:<br />
<br />
<br />
Kvadrupol (Q) eller trippel kvadrupol (QQQ)<br />
o Til små molekyler og targeted analysis.<br />
o QQQ typisk til rutine bruk kombinert med MRM på grunn av høy<br />
sensitivitet.<br />
Time-of-flight (TOF)<br />
o Til proteiner (på grunn av bedre masse oppløsning).
Ion-trap (IT) eller orbitrap (OT)<br />
o Til proteomikk/metabolomikk.<br />
o Bedre masse oppløsning og mulighet for å utføre MS/MS.<br />
Ved Hormonlaboratoriet brukes to typer masseanalysatorer: QQQ (rutine, 25-<br />
hydroksy-vitamin D) og orbitrap (proteomikk/metabolomikk).<br />
1. Tyge Greibrokk, Elsa Lundanes, Knut E. Rasmussen, Kromatografi,<br />
Universitetsforlaget, <strong>Oslo</strong>, 1998, 3.utgave.<br />
2. Naijun Wu, Andrew M. Clausen, Fundamentals and practical aspects of<br />
ultrahigh pressure liquid chromatography for fast separations, J. Sep. Sci.<br />
(2007), 30, 1167-1182.<br />
3. Colin F. Poole, The essence of Chromatography, Elsevier, Amsterdam, 2003,<br />
1. utgave