Elucigene CF-EU2v1 - Gen-Probe, Inc.
Elucigene CF-EU2v1 - Gen-Probe, Inc.
Elucigene CF-EU2v1 - Gen-Probe, Inc.
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
<strong>Elucigene</strong> ® <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong><br />
Brugervejledning<br />
ELUCIGENE er et varemærke tilhørende <strong>Gen</strong>-<strong>Probe</strong> Life Sciences Ltd.<br />
ARMS er et varemærke tilhørende AstraZeneca UK Ltd.<br />
QIAAMP er et varemærke tilhørende Qiagen GmbH.<br />
PICOGREEN er et varemærke tilhørende Molecular <strong>Probe</strong>s <strong>Inc</strong>.<br />
<strong>Elucigene</strong>sættene er udviklet og fremstillet af <strong>Gen</strong>-<strong>Probe</strong> Life Sciences Ltd. inden for<br />
kvalitetssystemer, der er godkendt ifølge ISO9001:2008 og ISO13485:2003.<br />
<strong>Gen</strong>eMarker er et varemærke tilhørende Soft<strong>Gen</strong>etics Corporation.<br />
GENEMAPPER, VIC og PET er varemærker tilhørende Applied Biosystems, LLC.<br />
NED, POP-6, POP-7 og Hi-Di er varemærker tilhørende Life Technologies<br />
Corporation<br />
MEDDELELSE TIL KØBEREN: BEGRÆNSET LICENS<br />
Polynukleotider mærket med farvestoffet VIC, NED og PET og/eller deres brug, kan være<br />
beskyttet af et eller flere patenter tilhørende Applied Biosystems, LLC. Købsprisen af<br />
dette produkt inkluderer begrænsede, ikke-overdragelige rettigheder under visse krav i<br />
visse patenter tilhørende Applied Biosystems, LLC om kun at bruge denne mængde<br />
produkt og kun til køberens aktiviteter til detektion af mål inden for human diagnostik. Der<br />
gives ingen andre rettigheder. Yderligere oplysninger om købslicens med hensyn til de<br />
ovenfor anførte farvestoffer, kan rekvireres hos Director of Licensing, Applied<br />
Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.<br />
Fremstillet af <strong>Gen</strong>-<strong>Probe</strong> Life Sciences Ltd.<br />
Heron House<br />
Oaks Business Park<br />
Crewe Road<br />
Wythenshawe<br />
Manchester<br />
M23 9HZ<br />
For salgsafdeling, kundeservice og teknisk support:<br />
T: +49 (0) 6122 7076 451<br />
F: +49 (0) 6122 7076 155<br />
E: customerservice@gen-probe.eu<br />
E: technicalsupport@gen-probe.eu<br />
Copyright 2011 <strong>Gen</strong>-<strong>Probe</strong> Life Sciences Ltd.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 1 af 25
Tilsigtet anvendelse<br />
<strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong><br />
Katalogkode: <strong>CF</strong>2EUB2 – 50 test<br />
Til simultan in vitro kvalitativ detektion af nedenstående humane <strong>CF</strong>TR-genmutationer<br />
(Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) i DNA udtaget fra fuldblod<br />
(EDTA-konserveret) og tørrede blodpletter:<br />
Traditionel I henhold til HGVSretningslinjerne<br />
<strong>CF</strong>TRdele2,3 c.54-<br />
5940_273+1025del21kb<br />
E60X c.178G>T;<br />
p.Glu60X<br />
P67L c.200C>T;<br />
p.Pro67Leu<br />
G85E c.254G>A;<br />
p.Gly85Glu<br />
394delTT c.262_263delTT;<br />
p.Leu88Ilefs*22<br />
444delA c.313delA;<br />
p.Ile105Serfs*2<br />
R117C c.349C>T;<br />
p.Arg117Cys<br />
R117H c.350G>A;<br />
p.Arg117His<br />
Y122X c.366T>A;<br />
p.Tyr122X<br />
Traditionel I henhold til HGVSretningslinjerne<br />
G551D c.1652G>A;<br />
p.Gly551Asp<br />
R553X c.1657C>T;<br />
p.Arg553X<br />
R560T c.1679G>C;<br />
p.Arg560Thr<br />
1811+1.6kbA>G c.1679+1.6kbA>G<br />
1898+1G>A c.1766+1G>A<br />
2143delT c.2010delT;<br />
p.Leu671X<br />
2184delA c.2052delA;<br />
p.Lys684fs<br />
2347delG c.2215delG;<br />
p.Val739Tyrfs*16<br />
W846X c.2538G>A;<br />
p.Trp846X<br />
621+1G>T c.489+1G>T 2789+5G>A c.2657+5G>A<br />
711+1G>T c.579+1G>T Q890X c.2668C>T;<br />
p.Gln890X<br />
L206W c.617T>G;<br />
p.Leu206Trp<br />
1078delT c.948delT;<br />
p.Phe316fs<br />
R334W c.1000C>T;<br />
p.Arg334Trp<br />
R347P c.1040G>C;<br />
p.Arg347Pro<br />
R347H c.1040G>A;<br />
p.Arg347His<br />
A455E c.1364C>A;<br />
p.Ala455Glu<br />
3120+1G>A c.2988+1G>A<br />
3272-26A>G c. 3140-26A>G<br />
R1066C c.3196C>T;<br />
p.Arg1066Cys<br />
Y1092X(C>A) c.3276C>A;<br />
p.Tyr1092X<br />
M1101K c.3302T>A;<br />
p.Met1101Lys<br />
D1152H c.3454G>C;<br />
p.Asp1152His<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 2 af 25
Traditionel I henhold til HGVSretningslinjerne<br />
I507del c.1519_1521delATC;<br />
p.Ile507del<br />
F508del c.1521_1523delCTT;<br />
p.Phe508del<br />
1677delTA c.1545_1546delTA;<br />
p.Tyr515X<br />
V520F c.1558G>T;<br />
p.Val 520Phe<br />
Traditionel I henhold til HGVSretningslinjerne<br />
R1158X c.3472C>T;<br />
p.Arg1158X<br />
R1162X c.3484C>T;<br />
p.Arg1162X<br />
3659delC c.3528delC;<br />
p.Lys1177fs<br />
3849+10kbC>T c.3717+10kbC>T<br />
1717-1G>A c.1585-1G>A S1251N c.3752G>A;<br />
p.Ser1251Asn<br />
G542X c.1624G>T;<br />
p.Gly542X<br />
S549R(T>G) c.1647T>G;<br />
p.Ser549Arg<br />
S549N c.1646G>A;<br />
p.Ser549Asn<br />
3905insT c.3773dupT;<br />
p.Leu1258fs<br />
W1282X c.3846G>A;<br />
p.Trp1282X<br />
N1303K c.3909C>G;<br />
p.Asn1303Lys<br />
<strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> kan skelne mellem en person, der er heterozygot og homozygot for alle<br />
ovenstående mutationer og varianter, med undtagelsen af S549R(T>G) – se afsnittet om<br />
krydsreaktivitet i dette dokument.<br />
Resume og forklaring<br />
Cystisk fibrose (<strong>CF</strong>) er den mest almindelige livsbegrænsende (autosomal recessiv)<br />
sygdom, i den hvide race. Sygdommen optræder ved 1 ud af 3200 levende fødsler i den<br />
hvide race (1). I den hvide race er den heterozygote hyppighed ca. 1:25.<br />
Cystisk fibrose påvirker epitelceller i flere organer, hvilket resulterer i en kompleks<br />
multisystemsygdom, der inkluderer exokrin pankreas, tarmene, luftvejene, mandlige<br />
genetalia, det hepatobiliære system og exokrine svedkirtler. Sygdommen manifesterer sig<br />
forskelligt afhængigt af sværhedsgraden af <strong>CF</strong>TR-mutationerne (2), genetiske<br />
modifikatorer (3) og miljømæssige faktorer (4). Det kan rangere fra tidlig død i<br />
barndommen grundet progredierende obstruktiv lungesygdom med bronchiectasia, til<br />
pankreasinsufficiens med gradvis progredierende obstruktiv lungesygdom i de unge år og<br />
øget hyppighed af hospitalsindlæggelser for lungesygdom i den tidlige voksenalder, til<br />
recidiverende sinusitis og bronkitis eller mandlig infertilitet i den tidlige voksenalder.<br />
Almindeligvis stilles diagnosen cystisk fibrose hos personer med en eller flere<br />
karakteristiske symptomer på <strong>CF</strong> samt evidens for en fejl i <strong>CF</strong>TR-funktionen, baseret på<br />
en af følgende: Tilstedeværelsen af to sygdomsforårsagende mutationer i <strong>CF</strong>TR- genet<br />
eller to unormale kvantitative pilocarpin iontoforese svedkloridværdier (>60 mEq/l) eller<br />
transepithelial NPD-målinger (Nasal Potential Difference), der er karakteristiske for <strong>CF</strong>.<br />
Detektionsraten for <strong>CF</strong>TR-mutationer varierer, alt afhængig af testmetoden og etnisk<br />
baggrund. Hos visse symptomatiske personer vil kun én eller ingen<br />
sygdomsforårsagende mutation kunne detekteres. Hos nogle bærere kan den<br />
sygdomsforårsagende mutation ikke detekteres.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 3 af 25
<strong>CF</strong>TR-relaterede lidelser er nedarvet på en autosomal recessiv måde. Søskende af en<br />
proband med cystisk fibrose har 25 % chance for at blive afficeret, 50 % chance for at<br />
være asymptomatiske bærere, og 25 % chance for at være ikke-afficerede og ikke<br />
bærere. Molekylærgenetisk testning for den/de sygdomsforårsagende mutation(er) i<br />
<strong>CF</strong>TR-genet bruges til detektion af en bærer i populations screenings programmer. Det er<br />
muligt at teste alle graviditeter med øget risiko for <strong>CF</strong>TR-relateret sygdom, hvis de<br />
sygdomsforårsagende mutationer i familien er kendt.<br />
Der er siden opdagelsen af <strong>CF</strong>TR-genet i 1989 (5) blevet beskrevet mere end 1700<br />
mutationer og varianter i genet (6). Mange af disse mutationer er “private”, dvs. de kun er<br />
beskrevet hos en patient og/eller familie. Rutinetestning for alle de mulige mutationer er<br />
hverken mulig eller omkostningseffektiv, og er derfor begrænset til testning for de mest<br />
almindelige mutationer. <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> er et cystisk fibrose-testkit, der er udviklet specifikt<br />
med henblik på de mest almindeligt forekommende mutationer hos populationer af<br />
europæisk afstamning. Analysen identificerer i alt 50 mutationer og analyserer også<br />
intron 8 polyT-området med nøjagtig måling af den tilstødende TG-gentagelse.<br />
Det polymorfe thymidinområde ved overgangen mellem intron 8 og exon 9 påvirker<br />
transkriptionen. Antallet af thymidinrester (5T, 7T eller 9T) påvirker<br />
splejsningseffektiviteten af exon 9, hvis 5T-allelet er tilstede, vil en del af exon<br />
9-transkripterne ikke være tilstede, hvilket vil resultere i et ikke-fungerende protein og<br />
forskellige <strong>CF</strong>-symptomer. Det er rapporteret at antallet af TG-gentagelser 5' til<br />
polytymidinområdet også kan påvirke splejsning af exon 9 (7). Findes de på det samme<br />
allel som 5T-varianten vil et længere antal TG-gentagelser være ensbetydende med at en<br />
højere andel af <strong>CF</strong>TR-transkripterne vil mangle exon 9. Antallet af TG-gentagelser kan<br />
påvises med <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> ved at bestemme størrelsen af 5T-amplikonspidser.<br />
Funktionsprincip<br />
Den metode, der anvendes med <strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>-kittet, anvender fluorescerende<br />
ARMS (Amplification Refractory Mutation System) allelspecifik amplifikationsteknologi,<br />
som detekterer punktmutationer, indsættelser og deletioner i DNA (8). Princippet bag<br />
ARMS er at oligonukleotider med en 3’ rest, der ikke passer sammen, ikke vil fungere<br />
som PCR-primere (Polymerase Chain Reaction) under specifikke forhold. Valget af<br />
passende oligonukleotider tillader forstærkning og detektering af specifikke mutante eller<br />
normale DNA-sekvenser. Amplificerede sekvenser (amplikoner) separeres med<br />
kapillærelektroforese ved hjælp af en genetisk analysator fra Applied Biosystems<br />
(<strong>Gen</strong>etic Analyzer). Analysesoftware gør det muligt at identificere og mærke amplikoner i<br />
henhold til deres størrelse og farve.<br />
<strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> er en meget multipleks analyse, der består af to (A og B) PCRreaktioner.<br />
Halvtreds mutante sekvenser i <strong>CF</strong>TR-genet påvises i A-blandingen og<br />
visualiseres som blå amplikonspidser. Tilsvarende ikke-muterede normale (vildtype)<br />
sekvenser påvises i B-blandingen og visualiseres som grønne amplikonspidser. Ablandingen<br />
påviser også en normal sekvens for den hyppigst observerede mutation, der<br />
forårsager cystisk fibrose hos hvide populationer, kaldet F508del og visualiseres som en<br />
grøn amplikonspids. Desuden påvises gentagne polyT-sekvenser i A-blandingen og<br />
visualiseres som sorte amplikonspidser. Interne amplifikationskontrolmarkører (ikkecystisk<br />
fibrose) inkluderes i både A- og B-blandingerne for at overvåge effektiviteten af<br />
prøveamplifikationen og visualiseres som røde amplikonspidser.<br />
Advarsler og forholdsregler<br />
1. Til in vitro-diagnostik.<br />
2. DNA-kontrollen, der følger med dette sæt, er af human oprindelse og er blevet testet<br />
uafhængigt med en PCR-baseret analyse og fandtes at være negativ for Hepatitis B<br />
virus (HBV), Hepatitis C virus (HCV) og Human immundefekt virus 1 (HIV1).<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 4 af 25
3. Vær forsigtig ved håndtering af materiale af human oprindelse. Alle prøver bør anses<br />
som potentielt smittefarlige. Ingen testmetode kan give fuld sikkerhed for, at HBV,<br />
HCV, HIV 1 eller andre smitstoffer ikke er til stede. Håndtering af prøver og<br />
testkomponenter, deres brug, opbevaring og bortskaffelse skal ske i<br />
overensstemmelse med nationale bestemmelser og lovgivning vedrørende biologisk<br />
risikomateriale.<br />
4. Alle komponenter skal opbevares under -20 °C i mørke. De fluorescerende<br />
farvestoffer, der anvendes i dette produkt, er lysfølsomme. Undgå at udsætte dem for<br />
lys i længere tid. Bortskaffes 3 måneder efter åbning.<br />
5. I overensstemmelse med aktuel god laboratoriepraksis bør laboratorier behandle<br />
deres egne interne kvalitetsprøver af kendt genotype i hver analyse, så procedurens<br />
validitet kan vurderes.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 5 af 25
Symboler anvendt på etiketter<br />
Symbolerne anvendt på alle etiketter og emballage er i overensstemmelse med den<br />
harmoniserede standard EN 980<br />
REF<br />
LOT<br />
X°<br />
C<br />
Producent<br />
Antal test<br />
Se brugsanvisningen<br />
Opbevares under den angivne temperatur<br />
Anvend før den angivne dato<br />
Katalogkode<br />
Lot- eller batchnummer<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 6 af 25
Materialer der følger med<br />
Reagenserne skal opbevares i et område uden kontaminerende DNA eller PCR.<br />
Alle reagenser leveres klar til brug. Uåbnede og åbnede reagenser skal opbevares ved<br />
-20 °C. Åbnede reagenser kan opbevares i op til 3 måneder.<br />
Der leveres tilstrækkeligt materiale til 50 test:<br />
2 x 120 µl hætteglas <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> A-primerblanding, indeholdende primere til<br />
forstærkning af følgende mutante alleler R347H, R347P, 2789+5G>A, 3120+1G>A,<br />
711+1G>T, R334W, I507del, F508del, 3849+10kbC>T, 1677delTA, 1078delT,<br />
V520F, L206W, W1282X, R560T, 2347delG, Q890X, R553X, G551D, S549N,<br />
M1101K, G542X, 3905insT, Y1092X(C>A), S1251N, 444delA, 1811+1.6kbA>G,<br />
1717-1G>A, R117H, R117C, N1303K, Y122X, 394delTT, G85E, R1066C,<br />
1898+1G>A, W846X, 2184delA, D1152H, <strong>CF</strong>TRdele2,3, P67L, 2143delT, E60X,<br />
3659delC, 3272-26A>G, 621+1G>T, A455E, R1162X og R1158X. Denne blanding<br />
indeholder også vildtype primere til detektion af normale F508del-alleler, primere til<br />
detektion af polythymidinvarianter, IVS8-5T, IVS8-7T, IVS8-9T og primere til<br />
identifikation af 2 hypervariable “short tandem repeat” STR-markører – (<strong>CF</strong>2EUTA).<br />
2 x 120 µl hætteglas <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> B-primerblanding, der indeholder vildtype primere til<br />
forstærkning af de normale alleler i de mutanter, der forstærkes af Aprimerblandingen<br />
med undtagelse af F508del, det normale allel, som forstærkes af<br />
primere inkluderet i A-primerblandingen. Denne blanding indeholder også primere til<br />
identifikation af 2 hypervariable STR-markører – (<strong>CF</strong>2EUTB).<br />
2 x 400 µl hætteglas PCR-masterblanding, der indeholder HotStart Taq DNApolymerase<br />
og deoxynukleotidtrifosfater i buffer – (CR000TM).<br />
1 x 50 µl hætteglas DNA-kontrol på 6 ng/µl, normal for mutationer detekteret med<br />
<strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> – (CR006TX)<br />
Nødvendige materialer, der ikke medfølger<br />
Laboratorieutensilier – handsker, mikrofuge-prøveglas med skruelåg, 0,2 ml PCRhætteglas<br />
eller mikrotiterplader anbefalet af producenten af den anvendte termiske<br />
variator, pipettespidser.<br />
Forberedelse af DNA – QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, kat. nr. 51304/51306) eller<br />
tilsvarende.<br />
Kapillærelektroforese – <strong>Gen</strong>eScan 600 LIZ størrelsesstandard (ABI kat. nr. 4366589),<br />
<strong>Gen</strong>eScan 600v2 LIZ størrelsesstandard (ABI kat. nr. 4408399), Multi-capillary DS-33<br />
(farvestofsæt G5) matrixstandard (ABI kat. nr. 4345833), POP-6 polymer (ABI kat. nr.<br />
4316357) eller POP-7 polymer (ABI kat. nr. 4352759), 10x genetisk analysator buffer (ABI<br />
kat. nr. 402824) og Hi-Di-formamid (ABI kat. nr. 4311320).<br />
Bemærk: Sørg for, at alle anvendte materialer ikke har overskredet producentens<br />
udløbsdato.<br />
Påkrævet udstyr<br />
Laboratorieudstyr – præcisionspipetter (2 sæt: 1 til håndtering før amplifikation og 1 til<br />
håndtering efter amplifikation), beskyttelsestøj, vortex-mixer, mikrofuge, centrifuge til<br />
mikrotiterplade med 96 brønde.<br />
PCR-amplifikation – Termisk variator, der rummer mikrotiterplader med 96 brønde eller<br />
0,2 ml hætteglas med en temperaturnøjagtighed på mindst +/-1 °C mellem 33 °C og<br />
100 °C og statisk temperaturensartethed på +/-1 °C.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 7 af 25
Bemærk: Den termiske variator skal vedligeholdes regelmæssigt i overensstemmelse<br />
med producentens anvisninger og kalibreres for at sikre nøjagtig PCR-variation og<br />
optimal funktion. <strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>-analysen blev udviklet på termiske variatorer fra<br />
Applied Biosystems 9700. Andre mærker og modeler bør testes fuldt ud og evalueres for<br />
optimal funktion af brugeren inden rapportering af resultater med <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>.<br />
Kapillærelektroforese – ABI 3130/3500 genetisk analysator (med <strong>Gen</strong>eMapper<br />
fragmentanalysesoftware), 36 cm eller 50 cm (ABI3500) kapillærarray, 96-brønds optiske<br />
plader, 96-brønds septas, 96-brønds kassetter.<br />
Bemærk: Udstyr til kapillærelektroforese skal vedligeholdes regelmæssigt i<br />
overensstemmelse med producentens anvisninger og kalibreres for at sikre optimal<br />
funktion.<br />
Prøvetagning og opbevaring<br />
Det er evalueret, at fuldblodsprøver (EDTA) og tørrede blodpletter er forenelige med<br />
denne test.<br />
Prøveudtagningsudstyr har til tider vist sig at være skadeligt for integriteten af visse<br />
analytter, og kan derfor interferere med nogle metode-teknologier (9). Det anbefales, at<br />
hver bruger sikrer, at det valgte udstyr anvendes i overensstemmelse med producentens<br />
anvisninger, og at prøvetagningsudstyret er foreneligt med denne test.<br />
Blodprøver skal opbevares ved -20 °C inden forberedelse af DNA. Undgå gentagen<br />
nedfrysning og optøning.<br />
Forberedelse af DNA fra fuldblodsprøver (EDTA)<br />
Der opnås konsistent resultater med DNA udtaget med QIAamp 96 DNA Blood Kit (eller<br />
QIAamp DNA Mini Kit med proteinase K) i henhold til den protokol, der er beskrevet i<br />
QIAamp-håndbogen, hvor der startes med 200 µl flydende fuldblod og eluerende i 200 µl<br />
vand til molekylærbiologi.<br />
Forberedelse af DNA fra tørrede blodpletter<br />
Der opnås konsistent resultater med DNA udtaget med QIAamp DNA Mini Kit i henhold til<br />
den protokol, der er beskrevet i QIAamp-håndbogen, men startende med 2 x 3 mm skiver<br />
fra en tørret blodplet og eluerende i 100 µl vand til molekylærbiologi.<br />
Det anbefales, at alternative metoder til udtagning af DNA og prøvetyper nøje evalueres<br />
med <strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>-testen inden resultaterne anvendes til diagnostik.<br />
Vigtige overvejelser – DNA-mængde<br />
Under optimale PCR-forhold og ved brug af de anbefalede prøveinjektionsindstillinger (se<br />
bemærkning i afsnittet Kapillærelektroforese) givet i kørselsmodulerne for kapillærkolonnen<br />
opnås der rutinemæssigt acceptable resultater fra DNA udtaget ved hjælp af<br />
ovenstående metoder ved koncentrationer på mellem 1,5 ng/µl og 25 ng/µl.<br />
Kvantificeringen af DNA er meget vigtig, og koncentrationen af hver DNA-prøve, der skal<br />
testes, bør måles for at sikre optimale resultater. Teknikker, som f.eks. PicoGreen<br />
fluorescens eller uUV-absorbans er acceptable. På grund af variation i DNAkvantificeringsteknikker<br />
bør brugeren overveje følgende vejledning:<br />
Meget store mængder DNA vil øge sandsynligheden for, at baggrundsspidser<br />
mærkes af analysesoftwaren. Følgende trin kan tages for at reducere<br />
sandsynligheden for, at baggrundsspidser mærkes.<br />
Fortynd DNA-prøven og forstærk igen<br />
Reducer injektionstiden – se afsnittet Kapillærelektroforese<br />
Forøg minimumstærkslen for spidsamplitude – se <strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong><br />
vejledning til analysesoftware<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 8 af 25
Meget små mængder DNA vil øge sandsynligheden for, at diagnostiske spidser er<br />
svage og ikke mærket af analysesoftwaren. Følgende trin kan tages for at forøge<br />
signalet.<br />
Forøg injektionstiden til 36 sekunder (anbefales stærkt for udtagninger af<br />
blodpletter) – se afsnittet Kapillærelektroforese<br />
Udtag prøven fra blodpletten igen og eluer i reduceret vandvolumen (50 µl)<br />
Forøg antallet af blodpletter til udtagning til 4 x 3 mm skiver<br />
Vigtige overvejelser – DNA-kvalitet<br />
<strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> er en meget multipleks analyse og kræver effektiv PCR-amplifikation for at<br />
fungere optimalt. DNA-kvaliteten kan afgøre PCR-processens effektivitet. Hæmmere, der<br />
udtages samtidigt med DNA-prøven, kan resultere i en suboptimal amplifikation, der fører<br />
til svage og dårligt afbalancerede spidser. <strong>Gen</strong>-<strong>Probe</strong> har valideret brugen af QIAamp<br />
96 DNA Blood Kit og QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH) med <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> kittet.<br />
Andre DNA-udtagningskits eller metoder bør valideres og optimeres til brug med<br />
<strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>.<br />
Bemærk: Se <strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> fejlfindingsvejledningen for yderligere oplysninger.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 9 af 25
Testprotokol<br />
Kontrol af PCR-kontaminering<br />
PCR-processen genererer et stort antal forstærkede produkter (amplikoner) og udgør en<br />
høj risiko for kontaminering, hvilket kan medføre falske resultater. Kontaminering kan<br />
opstå fra to kilder:<br />
Krydskontaminering – kontaminering af prøven med ikke-forstærket materiale fra<br />
miljøet eller andre prøver, som indeholder målsekvensen.<br />
Kontaminering af slutproduktet – kontaminering af prøven med amplikoner fra<br />
tidligere PCR-processer, der fører til amplifikation af både mål- og kontaminantamplikoner.<br />
Laboratorier, der udfører PCR, bør være opmærksom på disse kontamineringskilder og<br />
have procedurer på plads, som væsentligt reducerer risikoen for kontaminering. Metoder<br />
til at kontrollere kontaminering er veldokumenterede (10) og inkluderer laboratoriernes<br />
fysiske design, arbejdsgang, prøvehåndteringsprocedurer og kemiske og enzymatiske<br />
tilgange. Veldefinerede og gode laboratorieprocedurer er essentielle for at kontrollere<br />
PCR-kontaminering og skal implementeres inden testning af kliniske prøver.<br />
Amplifikationsprocedure<br />
Bemærk: For at minimere risikoen for kontaminering, skal trin 3-5 udføres i et område,<br />
hvor der ikke er noget PCR-produkt tilstede og helst i et laminært flowsystem.<br />
1. Programmér den termiske variator til en éttrinscyklus, som aktiverer HotStart Taq ved<br />
94 °C i 20 minutter, forbundet til et amplifikationscyklusprogram på 1 minut ved 94 °C<br />
(denaturering), 2 minutter ved 58 °C (hærdning) og 1 minut ved 72 °C (udvidelse) i<br />
30 cyklusser. Dette bør forbindes med en 20-minutters tidsforsinkelsesfil ved 72 °C<br />
(udvidelse) i den endelige cyklus.<br />
2. Der skal inkluderes en negativ kontrol i hver PCR-kørsel.<br />
3. Tø hætteglassene med Primer Mix og PCR Master Mix og centrifuger kort for at<br />
samle indholdet på bunden af hætteglassene. Bland forsigtigt ved at hvirvle og kort<br />
centrifugere hætteglassene igen. Forbered tilstrækkelig Reaction Mix til det antal<br />
prøver og kontroller, der skal testes (Tabel 1).<br />
Bemærk: PCR-masterblandingen er viskøs og det skal sikres, at de korrekte<br />
voluminer håndteres. Det anbefales, at PCR-masterblandingen tilføjes de tidligere<br />
dispenserede primerblandinger for at sikre, at al væske dispenseres fra pipetten og<br />
ind i primer-blandingen.<br />
Bemærk: Brug ikke forskellige blandinger eller komponenter fra forskellige lots af<br />
<strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>-kittet.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 10 af 25
Enzymaktivering Cyklusprogram<br />
Omgivelsestemperatur<br />
94 °C<br />
20 min.<br />
Tabel 1: Sammensætning af reaktionsblanding<br />
4. Pipettér 10 μl af hver reaktionsblanding ned i bunden af de korrekt mærkede 0,2 ml<br />
PCR-hætteglas eller plader.<br />
5. Tilsæt med nye pipettespidser 2,5 μl test-DNA-prøve til hver af hætteglassene og sæt<br />
låg på. Der må ikke tilføjes DNA til hætteglasset til negativ kontrol. Tilsæt i stedet<br />
2,5 µl sterilt deioniseret vand.<br />
6. Centrifugér PCR-hætteglassene kort for at samle indholdet på bunden af<br />
hætteglassene.<br />
7. Sæt hætteglassene godt fast i PCR-maskinens varmeblok. Start 94 °C<br />
éttrinscyklussen efterfulgt af amplifikationscyklusprogrammet.<br />
8. Når amplifikationscyklusprogrammet er fuldført, kan prøverne opbevares ved<br />
stuetemperatur natten over eller ved 2-8 °C i op til 7 dage i mørke inden analyse med<br />
kapillærelektroforese.<br />
Kapillærelektroforese<br />
94 °C<br />
1 min.<br />
58 °C<br />
2 min.<br />
30 cyklusser<br />
72 °C<br />
1 min.<br />
Endelig udvidelse<br />
72 °C<br />
20 min.<br />
Antal prøver, der skal testes<br />
1 10 25 50<br />
Primer-blanding (μl) 4,5 45 112,5 225<br />
PCR-masterblanding (μl) 7,5 75 187,5 375<br />
I alt (μl) 12 120 300 600<br />
Det anbefales, at hver bruger sikrer, at det valgte kapillærelektroforeseudstyr anvendes i<br />
overensstemmelse med producentens anvisninger, og at udstyret er foreneligt med<br />
denne test. I denne sammenhæng er de vigtigste parametre polymeren og det<br />
kapillærarray. Der kan opnås optimale resultater ved brug af følgende<br />
kapillærelektroforeseforhold:<br />
1. Kombinér 6,8 μl GS600v2 LIZ størrelsesstandard med 250 μl Hi-Di formamid og<br />
bland godt (tilstrækkelig blanding til 16 brønde). Pipettér 15 μl blanding i hver brønd<br />
på en 96-brønds PRC-plade.<br />
2. Tilsæt 3 µl PCR-produkt fra hver af A- og B-blandingsamplifikationerne til separate<br />
brønde indeholdende den allerede pipetterede størrelsesstandard/formamidblanding<br />
(fra trin 1) i pladen.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 11 af 25
3. Denaturér PCR-produktet, der blev pipetteret i PCR-pladen på en termisk variator<br />
ved brug af følgende parametre: 94 °C i 3 minutter forbundet med 4 °C i<br />
30 sekunder.<br />
4. Centrifugér pladen kort for at samle indholdet på bunden af hætteglassene og for at<br />
fjerne eventuelle bobler i brøndene. Sæt den straks i den genetiske analysator.<br />
Bemærk: Prøveinjektionsindstillingerne kan ændres, så de passer til den mængde<br />
amplikon, der dannes under PCR, hvilket kan variere afhængig af den mængde af<br />
genomisk DNA, der blev tilsat. Der kan anvendes mindre amplikon til den kolonne,<br />
der skal analyseres, ved enten at reducere injektionens tid eller spænding. Omvendt<br />
kan der anvendes mere amplikon til den kolonne, der skal analyseres, ved enten at<br />
øge injektionens tid eller spænding. Tidligere forstærkede prøver kan injiceres igen<br />
flere gange med henblik på gentagen analyse – se <strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong><br />
fejlfindingsvejledning for yderligere oplysninger.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 12 af 25
ABI 3130-instrumenter:<br />
Der skal oprettes et <strong>CF</strong>-EU2-kørselsmodul og en protokol, som herefter kan bruges til<br />
hver <strong>CF</strong>-EU2-kørsel.<br />
Opret <strong>CF</strong>-EU2-kørselsmodulet i Module Manager (modulstyringen) i 3130<br />
dataindsamlingssoftwaren. Sørg for at følgende er valgt:<br />
• Type: Regular (Almindelig)<br />
• Template (Skabelon): FragmentAnalysis36_POP7<br />
• Indlæs indstillingerne fra nedenstående tabel:<br />
36 cm kapillærmodul<br />
# Parameternavn Værdi Område<br />
1 Oven Temperature (Ovntemperatur) 60 først 18…65 °C<br />
2 Poly_Fill_Vol. (poly-fyldmængde) 6500 6500…38000 trin<br />
3 Current Stability (Aktuel stabilitet) 5,0 først 0…2000 uA<br />
4 PreRun_Voltage<br />
(prækørselsspænding)<br />
15,0 0…15 kV<br />
5 Pre_Run_Time (prækørselstid) 180 1…1000 s<br />
6 Injection_Voltage (injektion_spænding) 3,0 1…15 kV<br />
7 Injection_Time (injektionstid) 12,0** 1…600 s<br />
8 Voltage_Number_Of_Steps<br />
(spænding antal trin)<br />
20 1…100 nk<br />
9 Voltage_Step_Interval<br />
(spændingstrininterval)<br />
15 1…60 s<br />
10 Data_Delay_Time (dataforsinkelsestid) 60 1…3600 s<br />
11 Run_Voltage (kørselsspænding) 15,0 0…15 kV<br />
12 Run_Time (kørselstid) 1200 300…14000 s<br />
** Forøg injektionstiden til 36 sekunder for analyse af DNA udtaget fra blodpletter.<br />
Bemærk: Den nødvendige “kørselstid” vil variere afhængig af den omgivende temperatur<br />
på det sted, hvor den genetiske analysator er installeret. Der henvises til<br />
brugervejledningen for Applied Biosystems 3130 genetiske analysator for<br />
yderligere oplysninger om oprettelse af kørselsmoduler.<br />
Opret <strong>CF</strong>-EU2-protokollen i Protocol Manager (protokolmanager), og sørg for at<br />
følgende er valgt:<br />
• Type: Regular (Almindelig)<br />
• Run Module (Kørselsmodul): <strong>CF</strong>-EU2 (se kørselsmodul ovenfor)<br />
• Dye Set (Farvestofsæt): G5<br />
Opret et prøveark ved hjælp af Plate Manager (pladestyring), for at køre prøverne, og<br />
sørg for at den korrekte protokol for <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> er valgt for instrumentprotokollen (se<br />
ovenfor).<br />
Bemærk: Der henvises til brugervejledningen for Applied Biosystems 3130 genetisk<br />
analysator for yderligere oplysninger om opstilling, betjening og fejlfinding af<br />
instrumentet.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 13 af 25
ABI 3500-instrumenter:<br />
Der skal oprettes en <strong>CF</strong>-EU2 Instrument Protocol (Instrumentprotokol), som herefter<br />
kan bruges til hver <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>-kørsel.<br />
Opret <strong>CF</strong>-EU2 Instrument Protocol (Instrumentprotokol) via 3500 Instrument Protocols<br />
Library (instrumentprotokolbiblioteket). Sørg for at følgende er valgt:<br />
• Run Module (Kørselsmodul): FragmentAnalysis50_POP7<br />
• Indlæs de indstillinger, der er angivet i billedet nedenfor:<br />
** Forøg injektionstiden til 36 sekunder for analyse af DNA udtaget fra blodpletter<br />
Opret en prøveplade for at køre prøverne ved at klikke på ‘Create Plate from Template’<br />
(opret plade fra skabelon) på ‘Dashboard’ (instrumentbrættet), og sørg for at den<br />
korrekte instrumentprotokol er blevet tildelt <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> (se ovenfor).<br />
Opstilling af prøveark for <strong>Gen</strong>eMarker:<br />
<strong>Gen</strong>eMarker softwaren muliggør direkte sammenligning af A- og B-data fra samme<br />
person. For at muliggøre dette, er det vigtigt at navngivningen af fsa-filen (rå uddatafil) er<br />
konsekvent på tværs af alle prøver og blandinger. Prøvearket skal indeholde det unikke<br />
prøvenavn for hver prøve, der skal testes, efterfulgt af enten _A eller _B, afhængig af<br />
hvilken blanding der testes. Hvis Plate ID (plade-id) skal inkluderes i fsa-navnet, skal det<br />
samme format bruges hver gang, f.eks. <strong>CF</strong>EU2 DDMMÅÅÅÅ.<br />
På 3130 bør parametrene “Results Destination” (resultatdestination) indstilles sådan, at<br />
prøvens navn inkluderes i fsa-filens navn, f.eks. <strong>CF</strong>EU2 DDMMÅÅÅÅ_1234,5_A_A01.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 14 af 25<br />
**
På 3500 bør filnavnkonventionen indstilles sådan, at prøvens navn inkluderes i fsa-filens<br />
navn, f.eks. <strong>CF</strong>EU2 DDMMÅÅÅÅ_1234,5_A_A01.<br />
Fortolkning af resultater<br />
PCR-fragmenterne vil under dataindsamlingen blive observeret som enten blå (mutante)<br />
eller grønne (vildtype) spidser på rådata-elektroferogrammet. En person har to kopier af<br />
<strong>CF</strong>TR-genet. Hvis disse kopier har samme sekvens på et vilkårligt sted, beskrives en<br />
person som homozygot på dette sted. Hvis kopierne er forskellige i sekvens på et<br />
vilkårligt sted, beskrives en person som heterozygot på dette sted.<br />
Når dataindsamlingen er færdig, bør <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> PCR-fragmenterne størrelsesbestemmes<br />
i forhold til GS600v2 LIZ-størrelsesstandarden ved hjælp af fragmentanalysesoftware.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 15 af 25
Der findes i dokumentet <strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> – vejledning til analysesoftware<br />
yderligere detaljerede retningslinjer omkring softwareindstillinger, analyse og<br />
fortolkning. Vejledning til analysesoftwareprocedurer for <strong>Gen</strong>eMapper og<br />
<strong>Gen</strong>eMarker softwaren kan findes på <strong>Gen</strong>-<strong>Probe</strong>s hjemmeside:<br />
www.gen-probe.com/global/products-services/elucigene-cf-eu2v1<br />
Resultaterne fra A-blandingen (mutant) bestemmer, hvorvidt en person er bærer af en<br />
mutation, og dette vises med en blå spids. Mutantblandingen indeholder også primere til<br />
det normale F508del-allel, og derfor kan denne blanding bestemme hvorvidt en person er<br />
normal for F508del (kun grøn spids), homozygot for F508del (kun blå spids) eller<br />
heterozygot for F508del (blå og grøn spids).<br />
Hvis der observeres nogen anden mutation, kan resultaterne fra B-blandingen (vildtype)<br />
analyseres for at bestemme homozygot eller heterozygot status. Tilstedeværelsen af en<br />
grøn spids for det specifikke allel i vildtypeblandingen indikerer, at personen er<br />
heterozygot. Hvis den grønne spids mangler, indikerer det, at personen er homozygot for<br />
denne specifikke mutation.<br />
Der er inkluderet hypervariable STR-markører (røde) i begge blandinger. Dette muliggør<br />
en sammenligning af den forstærkede prøve med mutantblandingen og den forstærkede<br />
prøve med vildtypeblandingen for at reducere muligheden for, at der er taget fejl af<br />
prøverne. En forskellig STR-profil i hver af de to blandinger indikerer, at det ikke er de<br />
rigtige prøver. Mangel på disse STR-markører indikerer en fejlslagen prøve.<br />
Tilstedeværelsen af STR-markørerne ved meget lave rfu'er indikerer en svag prøve, som<br />
bør analyseres med forsigtighed.<br />
Bemærk: Se fejlfindingsvejledningen for yderligere oplysninger.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 16 af 25
Detekterede markører<br />
Nedenstående tabel opsummerer de markører, der detekteres med <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>blandingen.<br />
Markørerne er angivet i henhold til størrelsesområdet for det observerede<br />
PCR-produkt.<br />
Detekterede markører<br />
Markør<br />
(Spids nr. )<br />
Markør<br />
Produkt bp størrelsesområde<br />
(3130/POP7 data)<br />
01 R347H 110.5-116.5<br />
02 R347P 117-123<br />
03 2789+5G>A 124-130<br />
04 3120+1G>A 132.5-138.5<br />
05 711+1G>T 141.5-147.5<br />
06 R334W 147.5-154<br />
07 I507del 156-162.5<br />
08 F508del 163-169<br />
09 3849+10KbC>T 172-178<br />
10 1677delTA 180-188.5<br />
11 1078delT 193-199<br />
12 V520F 206-211.5<br />
13 L206W 215-220<br />
14 W1282X 224.5-230.5<br />
15 R560T 234.5-240.5<br />
16 2347delG 242-246<br />
17 Q890X 250-252<br />
18 R553X 255.5-261.5<br />
19 G551D 265-267<br />
20 S549R(T>G)* 267.5-269.5<br />
21 S549N 275-280<br />
22 M1101K 282-288<br />
23 G542X 289-295.5<br />
24 3905insT 297-303.5<br />
25 Y1092X(C>A) 308-314<br />
26 S1251N 315-321<br />
27 444delA 323-326<br />
28 1811+1.6kbA>G 332-338<br />
29 1717-1G>A 341.5-347.5<br />
30 R117H 349-355<br />
31 R117C 357-360<br />
32 N1303K 360-366.5<br />
33 Y122X 367-373<br />
34 394delTT 377-383<br />
35 G85E 384-390<br />
36 R1066C 391-397<br />
37 1898+1G>A 398.5-404.5<br />
38 W846X 406-411<br />
39 2184delA 413-418<br />
40 D1152H 423-429<br />
41 <strong>CF</strong>TRdel2,3 433-439<br />
42 P67L 439.5-445.5<br />
43 2143delT 446-450.5<br />
44 E60X 453.5-460.5<br />
45 3659delC 461-465.5<br />
46 3272-26A>G 470-476<br />
47 621+1G>T 485.5-491.5<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 17 af 25
*S549R(T>G)<br />
Markør nr. Markør Produkt bp størrelsesområde<br />
(3130/POP7 data)<br />
48 A455E 496-503<br />
49 R1162X 506-512<br />
50 R1158X 516.5-524.5<br />
5T** IVS8-5T 110-130<br />
7T IVS8-7T 140-160<br />
9T IVS8-9T 175-195<br />
Spids 20 findes kun i A-blandingen.<br />
** 5T-allelstørrelser<br />
Markør<br />
Produkt bp<br />
Størrelses område<br />
(3130/POP7 data)<br />
5T (9) 117.25 – 118.75<br />
5T (10) 119.25 – 120.75<br />
5T (11) 121.25 – 122.75<br />
5T (12) 123.25 – 124.75<br />
5T (13) 125.25 – 126.75<br />
BEMÆRK: Markørstørrelserne kan variere afhængig af det anvendte instrument og<br />
polymer.<br />
Eksempler på fortolkning<br />
I507del<br />
Det er grundet placeringen af I507del-deletionen i <strong>CF</strong>TR-genet muligt at detektere<br />
tilstedeværelsen af denne markør gennem et 3 bp skift i størrelsen af F508del-spidsen,<br />
samt som en I507del mutant specifik spids.<br />
Der hvor der er et enkelt I507del mutant allel tilstede, vil I507del mutantens spids kunne<br />
ses som en blå spids ved ca. 159 bp. Der observeres en vildtypespids for F508 som<br />
værende tilstede, men på omkring halvdelen af den spidshøjde, der almindeligvis er<br />
forbundet med en homozygot vildtype genotype. Dette ses som en grøn spids ved<br />
omkring 167 bp. Der vil derudover kunne ses yderligere en grøn spids ved omkring<br />
164 bp.<br />
I507del heterozygot prøve<br />
En I507del/F508del-prøve vil give en skiftet grøn F508del WT-spids ved ca. 164 bp (3 bp<br />
mindre end normalt), en blå F508del M spids ved 166 bp og en blå I507del M spids ved<br />
omkring 159 bp.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 18 af 25
En I507del/I507del-prøve vil give en blå spids ved ca. 159 bp og en enkel grøn spids ved<br />
ca. 164 bp (3 bp mindre end den normale F508-spids, der observeres, når I507del ikke er<br />
tilstede).<br />
F508del<br />
Tilstedeværelsen af en F508del-mutation forhindrer I507del WT-primeren i at virke. En<br />
person, der er homozygot for F508del, vil derfor ikke have nogen I507del WT-spids i WTblandingen<br />
(se nedenfor).<br />
En mindre høj I507del WT-spids og 2 spidser med et mellemrum på 3 bp ved position 10<br />
og 12 i WT-blandingen (se nedenfor) vil kunne ses i B-blandingens resultater fra en<br />
person, som er heterozygot for F508del.<br />
Indsættelser og deletioner<br />
På grund af <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>-kittets design vil tilstedeværelsen af indsættelser eller deletioner<br />
mellem to modsatte primere resultere i størrelsesændringer af al det amplikon, der<br />
produceres mellem disse to primere. Ud over de 50 mutationer, der detekteres af <strong>CF</strong>-<br />
<strong>EU2v1</strong>-kittet, kan alle indsættelser og deletioner i de forstærkede målsekvenser<br />
detekteres med ændringen i den forventede amplikonstørrelse i vildtype (B)-blandingen.<br />
Disse er blevet opsat i tabelform og kan findes i et separat dokument på <strong>Gen</strong>-<strong>Probe</strong>s<br />
hjemmeside:<br />
www.gen-probe.com/global/products-services/elucigene-cf-eu2v1<br />
Eksempler på indsættelser og deletioner detekteret af kittet og den indvirkning, de har på<br />
B-blandingsprofilen vises herunder:<br />
F508del/1677delTA<br />
Der observeres to spidser med et mellemrum på 1 bp ved position 12 (V520F WT) i Bblandingens<br />
resultater fra en person, der er heterozygot for F508del/1677delTAmutationerne.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 19 af 25
V520F<br />
Der observeres en mindre høj vildtype spids ved position 10 (1677delTA WT) i Bblandingens<br />
resultater fra en person, der er heterozygot for V520F-mutationen, da dette<br />
forhindrer 1677delTA WT-primeren i at virke. Spids 10 og 12 vil forsvinde i resultaterne<br />
fra en person, der er homozygot for V520F-mutationen.<br />
394delTT<br />
Der observeres to spidser med et mellemrum på 2 bp ved position 35 (G85E WT), 42<br />
(P67L WT) og 44 (E60X WT) i B-blandingens resultater fra en person, der er heterozygot<br />
for 394delTT-mutationen. Spids 34 vil forsvinde og spids 35, 42 og 44 vil være den<br />
forventede højde, men skiftet 2 bp mindre end den forventede størrelse i resultaterne fra<br />
en person, der er homozygot for 394delTT-mutationen.<br />
F508del/<strong>CF</strong>TRdele2,3<br />
Der observeres reducerede spidshøjder ved position 34 (394delTT), 35 (G85E WT), 41<br />
(<strong>CF</strong>TRdele2,3 WT), 42 (P67L WT) og 44 (E60X WT) i B-blandingens resultater fra en<br />
person, der er heterozygot for <strong>CF</strong>TRdele2,3-mutationen. Spids 34, 35, 41, 42 og 44 vil<br />
forsvinde i resultaterne fra en person, der er homozygot for <strong>CF</strong>TRdele2,3-mutationen.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 20 af 25
444delA<br />
Der observeres to spidser med et mellemrum på 1 bp ved position 30 (R117H WT), 31<br />
(R117C WT), 33 (Y122X WT) og 47 (621+1 WT) i B-blandingens resultater fra en person,<br />
der er heterozygot for 444delA-mutationen. Spids 27 vil forsvinde og spids 30, 31, 33 og<br />
47 vil være den forventede højde, men skiftet 1 bp mindre end den forventede størrelse i<br />
resultaterne fra en person, der er homozygot for 444delA-mutationen.<br />
2347delG<br />
Der observeres to spidser med et mellemrum på 1 bp ved position 39 (2184delA WT) og<br />
43 (2143delT WT) i B-blandingens resultater fra en person, der er heterozygot for<br />
2347delG-mutationen. Spids 16 vil forsvinde og spids 39 og 43 vil være den forventede<br />
højde, men skiftet 1 bp mindre end den forventede størrelse i resultaterne fra en person,<br />
der er homozygot for 2347delG-mutationen.<br />
3905insT<br />
Der observeres to spidser med et mellemrum på 1 bp ved position 26 (S1251N WT) i Bblandingens<br />
resultater fra en person, der er heterozygot for 3905insT-mutationen. Spids<br />
24 vil forsvinde, og spids 26 vil være den forventede højde, men skiftet 1 bp større end<br />
den forventede størrelse i resultaterne fra en person, der er homozygot for 3905insTmutationen.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 21 af 25
R1158X<br />
Der observeres en reduceret spidshøjde ved position 49 (R1162X WT) i B-blandingens<br />
resultater fra en person, der er heterozygot for R1158X-mutationen. Spids 49 vil forsvinde<br />
i resultaterne fra en person, der er homozygot for R1158X-mutationen.<br />
Polymorfisme rs4148721 (delAT) i intron 19<br />
Der observeres to spidser med et mellemrum på 2 bp ved position 45 (3659delC WT), 49<br />
(R1162X WT) og 50 (R1158X WT) i B-blandingens resultater fra en person, der er<br />
heterozygot for polymorfismen rs4148721 (deletion af AT) i intron 19. Spids 45, 49 og 50<br />
vil være den forventede højde, men skiftet 2 bp mindre end den forventede størrelse i<br />
resultaterne fra en person, der er homozygot for polymorfismen rs4148721.<br />
Andre observationer<br />
V520F – Polymorfisme 1584G>A i exon 11<br />
Det er konstateret, at 1584G>A-polymorfismen interfererer med amplifikation af V520F<br />
mutant og vildtype sekvensen. Reduceret spidshøjde ved position 12 (V520F) vil kunne<br />
observeres i B-blandingen i en person, som er heterozygot for 1584G>A-polymorfismen.<br />
Spids 12 vil forsvinde fra B-blandingen i en person, som er homozygot for 1584G>Apolymorfismen.<br />
En person, som er heterozygot for F508del-mutationen og også<br />
heterozygot for 1584G>A-mutationen vil kun have en spids 12 i B-blandingen, snarere<br />
end de forventede to spidser ved position 12, der normalt ses i en F508del-heterozygot –<br />
se nedenstående eksempel. Spids 12 vil forsvinde fra A-blandingen i en person, som er<br />
heterozygot for V520F-blandingen og 1584G>A-polymorfismen på det samme allel. Et<br />
sådant resultat er ikke blevet observeret til dato og er sandsynligvis en sjælden<br />
kombination.<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 22 af 25
Krydsreaktivitet<br />
Det blev i så vid udstrækning som mulig under udviklingen af testen tilstræbt at undgå<br />
interferens med testfunktionen som følge af tilstedeværelsen af andre rapporterede<br />
polymorfismer og mutationer i <strong>CF</strong>TR-genet.<br />
Den sjældne mutation R1283M er blevet vurderet for krydsreaktivitet, og den blev ikke<br />
detekteret af <strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>-kittet. Følgende polymorfismer blev heller ikke<br />
detekteret af testen: 1655T/G (F508C), 1651A/G.<br />
Vurderingen af kendte mutationer og polymorfismer i <strong>CF</strong>TR-genet har understreget<br />
følgende virkning på resultaterne med <strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>-kittet:<br />
1. G551D mutant primer i A-blandingen vil også detektere S549RT>G-mutationen.<br />
Analysesoftwaren vil give den betegnelsen spids 20. Der vil ikke findes en tilsvarende<br />
vildtype spids i B-blandingen.<br />
2. 2184delA mutant primeren i A-blandingen vil krydsreagere med 2183AA>G-mutantens<br />
DNA-sekvens og resultere i en mutant spids ved position 2184delA.<br />
3. 1078delT mutant primeren i A-blandingen vil krydsreagere med F316L-mutantens<br />
DNA-sekvens og resultere i en mutant spids ved position 1078delT.<br />
4. R347P mutant primeren i A-blandingen vil krydsreagere med R347H-mutantens DNAsekvens<br />
og resultere i en mindre høj mutant spids ved position R347P sammenlignet<br />
med en sand R347P-spids.<br />
5. Tilstedeværelsen af F508C (1655T>G) polymorfismen vil resultere i en reduktion af<br />
højden af I507del-spidsen i <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> B-blandingen.<br />
6. Tilstedeværelsen af R117H vil resultere i en reduktion af højden af R117C-spidsen i<br />
<strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> B-blandingen. I en prøve, der er homozygot for R117H, vil R117C-spidsen<br />
mangle.<br />
7. Tilstedeværelsen af G85E vil resultere i en reduktion af højden af 394delTT-spidsen i<br />
<strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> B-blandingen. I en prøve, der er homozygot for G85E, vil 394delTT-spidsen<br />
mangle.<br />
8. Der kan sommetider observeres en meget lille artefaktspids i position I507del i<br />
resultaterne fra en F508del heterozygot og især en F508del homozygot prøve.<br />
9. Nedenstående mutationer, som ikke er blevet kontrolleret for eventuel krydsreaktivitet,<br />
grundet den manglende tilgængelighed af relevante prøver, kan interferere med<br />
testfunktionen: R117P, R117L, 1717-2A>G, 621+2T>C, 621+2T>G, R553G, R553Q,<br />
R347L, I506T, I506S, I506V og den sjældne kombination af I507del med<br />
polymorfismen 1651A/G.<br />
Funktionskarakteristika<br />
Der blev blindtestet ethundredogti DNA-prøver udtaget fra flydende fuldblod (EDTA) ved<br />
brug af <strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>. Fem prøver slog fejl efter PCR som følge af lav DNAkoncentration<br />
(mindre end 1,5 ng/μl). Blandt de resultater, der kunne tolkes, var 96<br />
normale, 5 var heterozygote for F508del, 1 var heterozygot for 1717-1G>A, 1 var<br />
heterozygot for G551D, 1 var heterozygot for 621+1G>T, 1 var heterozygot for G542X og<br />
1 var en sammensat heterozygot for G542X/F508del.<br />
Der blev blindtestet enoghalvfems DNA-prøver udtaget fra tørrede blodpletter ved brug af<br />
<strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>. Fem prøver blev ikke forstærket. Af de prøver, som blev<br />
forstærket, opfyldte 20 ikke analysekriterierne for fortolkning efter en injektion på<br />
12 sekunder på en 3500 genetisk analysator. Alle mislykkede prøver korrelerede med lav<br />
DNA-koncentration (mindre end 1,5 ng/μl). De 20 mislykkede prøver blev injiceret igen i<br />
36 sekunder på 3500 genetisk analysator og analyseret. 7 prøver opfyldte ikke<br />
analysekriterierne for fortolkning. Af de 79 prøver, som gav resultater, der kunne tolkes,<br />
var 38 normale, 5 var heterozygote for F508del, 3 var heterozygote for G551D, 3 var<br />
heterozygote for W1282X, 2 var heterozygote for D1152H og 2 var heterozygote for<br />
G542X. Fire sammensatte heterozygoter, 3120+1G>A/F508del, R117H/F508del,<br />
R1162X/F508del og R553X/F508del, blev også bestemt. Desuden blev følgende<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 23 af 25
heterozygote prøver hver observeret en enkel gang: E60X, G85E, 394delTT, Y122X,<br />
621+1G>T, 1078delT, R334W, R347P, A455E, I507del, 1717-1G>A, R553X,<br />
1811+1.6kbA>G, 1898+1G>A, 2184delA, W846X, 3272-26A>G, Y1092X, 3659delC,<br />
3849+10kbC>T, S1251N og N1303K.<br />
Seksogfyrre DNA-prøver, der repræsenterede alle 50 mutationer detekteret af <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>kittet,<br />
blev forstærket fem forskellige gange. Alle prøverne gav de forventede resultater<br />
uden nogen falsk negative eller falsk positive resultater, hvilket var ensbetydende med<br />
100 % klinisk specificitet og sensitivitet.<br />
Fejlfinding<br />
Denne brugsanvisning leveres for at sikre optimal analysefunktion. Brugere må ikke<br />
afvige fra de oplyste procedurer. Enhver afvigelse kan resultere i suboptimal funktion med<br />
data af dårlig kvalitet som resultat. En fejlfindingsvejledning fås på anmodning fra <strong>Gen</strong>-<br />
<strong>Probe</strong>, og den giver eksempler på og løsninger af nogle af de mest almindelige<br />
observationer med <strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong>, f.eks.:<br />
Ingen diagnostiske eller STR-spidser<br />
Svage diagnostiske eller STR-spidser<br />
For stort gennembrud/baggrundsspidser<br />
Umærkede spidser<br />
Svage FAM (mutante) spidser<br />
Ubalanceret A-blandingsprofil<br />
Ubalanceret B-blandingsprofil<br />
Delte spidser i B-blandingsprofil<br />
Kontakt venligst vores tekniske supportgruppe for at rekvirere en kopi af <strong>Elucigene</strong><br />
<strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> fejlfindingsvejledningen:<br />
T: +49 (0) 6122 7076 451<br />
F: +49 (0) 6122 7076 155<br />
E: technicalsupport@gen-probe.eu<br />
Procedurens begrænsninger<br />
1. De opnåede resultater fra dette eller enhver anden diagnostisk test bør kun<br />
anvendes og fortolkes i henhold til det samlede kliniske billede. <strong>Gen</strong>-<strong>Probe</strong> Life<br />
Sciences Ltd. er ikke ansvarlig for de kliniske beslutninger, der træffes.<br />
2. Den manglende tilstedeværelse af mutationer, som dette kit detekterer, er ikke en<br />
garanti for at der ikke findes andre mutationer i <strong>CF</strong>TR-genet. Der kan findes andre<br />
mutationer, som ikke detekteres af dette kit.<br />
3. Mutationer varierer i hyppighed i forskellige populationer. Data om hyppigheden af<br />
mutationer i forskellige populationer kan rekvireres hos The Cystic Fibrosis <strong>Gen</strong>etic<br />
Analysis Consortium (6).<br />
Brugeren af dette kit skal lægge vægt på disse punkter, når resultaterne rapporteres til<br />
den diagnosticerende kliniker/den genetiske rådgiver.<br />
Ansvarsfraskrivelse<br />
Resultater fra dette og andre diagnostiske analyser skal fortolkes sammen med de<br />
laboratorie- og kliniske data, der er tilgængelige for klinikeren.<br />
Disse <strong>Elucigene</strong> reagenser leveres til in vitro diagnostik.<br />
Der findes yderligere oplysninger om datafortolkning i <strong>Elucigene</strong> <strong>CF</strong>-<strong>EU2v1</strong> - vejledning til<br />
analysesoftwareprocedurer:<br />
www.gen-probe.com/global/products-services/elucigene-cf-eu2v1<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 24 af 25
Referencer<br />
1. Rosenstein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement.<br />
Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. J Pediatr. 1998;132:589–95.<br />
2. De Braekeleer M, Allard C, Leblanc JP, Simard F, Aubin G. <strong>Gen</strong>otype-phenotype<br />
correlation in cystic fibrosis patients compound heterozygous for the A455E mutation.<br />
Hum <strong>Gen</strong>et. 1997;101:208–11<br />
3. Drumm ML, Konstan MW, Schluchter MD, Handler A, Pace R, Zou F, Zariwala M,<br />
Fargo D, Xu A, Dunn JM, Darrah RJ, Dorfman R, Sandford AJ, Corey M, Zielenski J,<br />
Durie P, Goddard K, Yankaskas JR, Wright FA, Knowles MR. <strong>Gen</strong>etic modifiers of<br />
lung disease in cystic fibrosis. N Engl J Med. 2005;353:1443–53<br />
4. Goss CH, Newsom SA, Schildcrout JS, Sheppard L, Kaufman JD. Effect of ambient<br />
air pollution on pulmonary exacerbations and lung function in cystic fibrosis. Am J<br />
Respir Crit Care Med. 2004;169:816–21<br />
5. Kerem B, Rommens JM, Buchanan JA, Markiewicz D, Cox TK, Chakravarti A,<br />
Buchwald M, and Tsui LC. “Identification of the Cystic Fibrosis <strong>Gen</strong>e: <strong>Gen</strong>etic<br />
Analysis.” Science 1989; 245 (4922): 1073-8<br />
6. Cystic Fibrosis Mutation Database, www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app<br />
7. Joshua D. Groman et al. Variation in a Repeat Sequence Determines Whether a<br />
Common Variant of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator<br />
<strong>Gen</strong>e Is Pathogenic or Benign. Am J Hum <strong>Gen</strong>et. 2004; 74(1): 176–179.<br />
8. Newton CR et al. Analysis of any point mutation in DNA. The Amplification Refractory<br />
Mutation System (ARMS). Nucleic Acid Res 17: 2503-2516 (1989).<br />
9. Satsangi J et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343:1509-<br />
1510 (1994).<br />
10. PCR Primer: A Laboratory Manual, 2 nd edition. ColdSpring Harbour Laboratory Press:<br />
Section 1<br />
<strong>CF</strong>2EUBY002DA Rev.05/2012 Side 25 af 25