FLUORESCENSMIKROSKOPI

Fag SIF 4070 Cellebiologi,Vår2001 Labøving nr.3: Fluorescensmikroskopi
Oppgavens formål:
Labøving nr. 3
FLUORESCENSMIKROSKOPI
Gjøre studentene kjent med fluorescensmikroskopi og konfokal laser scanning mikroskopi

Fag SIF 4070 Cellebiologi, vår2001 Labøving nr. 3: Fluorescensmikroskopi
Absorpsjon og emisjon av lys.
Elektronisk eksitasjon av et molekyl består i at molekylet absorberer energi som forårsaker at et av
de løsest bundne elektronene overføres til en orbital med høyere energi. Fotonenes energi må da
tilsvare energiforskjellen mellom eksitert tilstand og grunntilstand. Et energidiagram såkalt
Jablonskidiagram er vist i Figur 1. Energitilstanden S0 er grunntilstand, og S1, S2 osv er henholdsvis
første og andre energinivå med spinnkvantetall J=0. Disse kalles singlettilstander. De tilsvarende
T1, T2 osv kalles triplettilstander med J=1. Hver triplettilstand har en litt lavere energi enn
tilsvarende singlettilstand. Overganger fra en singlet- til en triplettilstand der ΔJ≠0, er såkalt
spinnforbudte overganger og er typisk 10 9 ganger langsommere enn såkalte tillatte overganger
ΔJ=0. Forbudte overganger oppstår som følge av spin-bane koplinger.
Figur 1: Eksempel på et Jablonskidiagram for et molekyl som eksiteres fra S0 til S2. Overganger
ved eksitasjon eller emisjon av et foton er merket med rette piler (→) mens strålingsløse prosesser
som virbrasjonsrelaksasjon (vr), intern konversjon (ic) og system kryssing (isc) er markert med
bølgepil.
I tillegg til elektronisk eksitasjon kan molekyler også tilføres energi i form av vibrasjon og rotasjon
av atomære grupper. Vibrasjon skjer både langs lengdeaksen av en atomær binding (strekkvibrasjon)
og på tvers av bindingen (bøyings-vibrasjon). Vibrasjonseksitasjonsenergien ligger
vanligvis i området 0.05-0.5eV, dvs i den infrarøde delen av spekteret. Rotasjonsenergier er
vesentlig mindre enn energien av vekselvirkningen mellom molekyler i kondensert fase, og mindre
enn variasjonen i denne vekselvirkningen fra det ene molekylet til det andre. Rotasjonsnivåene kan
derfor bare detekteres i gassfase, og er ikke vist i Figur 1.
Det eksiterte molekylet kan falle tilbake til grunntilstand enten ved utsendelse av et foton eller ved
såkalte strålingsløse prosesser (figur 1). Utsendelse av et foton skjer ved fluorescens eller
fosforescens.
Fluorescens betegner utsendelsen av et foton ved tillatt (ΔJ=0) elektronisk deeksitasjon.
Hastighetskonstanten er typisk 10 8 – 10 9 s -1 dvs at dersom deeksitasjonen ikke skjer ved noen
annen prosess vil den eksiterte tilstanden ha en levetid 10 -8 – 10 -9 s.
Fosforesens betegner utsendelsen av et foton ved en forbudt overgang (ΔJ≠0) og skjer vanligvis fra
triplett T1 til singlett S0. Hastighetskonstanten for fosforescens er av størrelsesorden 1-10 -1 s -1 .
2

Fag SIF 4070 Cellebiologi, vår2001 Labøving nr. 3: Fluorescensmikroskopi
Fluorescens skjer i konkurranse med strålingsløse prosesser. De viktigste strålingsløse prosessene
er vibrasjonsrelaksasjon (Vr), intern konversjon (ic) og system kryssing (isc). Prosessene er vist i
Figur 1. Ved vibrasjonsrelaksasjon tapes vibrasjonsenergi til omgivelsene og dermed overgang fra
en høyere vibrasjonstilstand til en lavere. I kondensert fase vil denne prosessen skje meget raskt
med en hastighetskonstant på typiske 10 12 s -1 . Intern konversjon betegner overgangen mellom
forskjellige elektroniske tilstander med samme spinnkvantetall J. Hastighetskonstanten for ic er
10 12 -10 13 s -1 . Dette er den dominerende prosessen for overganger (deeksitasjon) mellom høyere
eksiterte tilstander. System kryssing betegner en spinnforbudt strålingsløs overgang mellom
elektroniske tilstander for eksempel S1 → T1, med en hastighetskonstant på 10 7 -10 11 s -1 .
Ved måling av fluorescens er kvanteutbytte en viktig parameter for fluorescensintensiteten.
Kvanteutbytte er gitt ved sannsynligheten for at absorpsjon av et foton skal gi opphav til
fluorescens, dvs
kf
Φf =
kf
+
der kf er hastighetskonstanten for fluorescens som konkurrerer med n andre prosesser med
hastighetskonstant ki.
Fluorescensintensiteten fra en belyst prøve med fluorescerende molekyler er gitt ved:
3
n
∑
i=
1
ki
If = ΦfΔI = Iεcl
der I er intensiteten til eksitasjonslyset som passerer en distanse l gjennom prøven.
Ekstingsjonskoeffisienten ε angir tverrsnittet for absorpsjon av lys med en gitt bølgelengde i en
prøve med fluorescerende molekyler i konsentrasjon c.
Absorpsjon og emisjon av fotoner foregår så hurtig at molekylets atomer ikke forandrer posisjon i
løpet av prosessen. Dette kalles Franck-Condon prinsippet og innebærer at kvantespranget må
representeres med vertikale linjer som vist i figur 2. Sannsynlighets- tverrsnittet for absorpsjon og
emisjon av et foton vil dermed avhenge av det romlige overlapp av bølgefunksjonen i begynnelsesog
sluttilstand. For absorpsjon vil de overganger som har størst tverrsnitt skje fra laveste
vibrasjonsnivå i grunntilstand til et høyere vibrasjonsnivå i den eksiterte tilstand. Når det gjelder
lysemisjon vil overganger hyppigst skjer fra laveste vibrasjonsnivå i S1 til eksitert vibrasjonsnivå i
grunntilstand, fordi vibrasjons-relaksasjon og intern konversjon er mye hurtigere prosesser en
fluorescens.
Figur 2: Franck-Condon prinsippet illustrert for absorpsjon fra S0 til S1. Absorpsjon foregår
hyppigst fra laveste vibrasjonsnivå i grunntilstand til et eksitert vibrasjonsnivå i S1. Fluorescens
skjer hyppigst fra laveste vibrasjonsnivå i S1 til eksitert vibrasjonsnivå i S0.

Fag SIF 4070 Cellebiologi, vår2001 Labøving nr. 3: Fluorescensmikroskopi
Fluorescens fra høyere eksiterte tilstander (S2, S3 osv) observeres sjelden fordi intern konversjon
mellom disse tilstandene er meget hurtig. Franck-Condon prinsippet medfører at
fluorescensspekteret vil ligge noe forskjøvet mot lavere energi og dermed høyere bølgelengder enn
absorpsjonsspekteret, slik som vist i figur 3. Denne forskyvningen kalles Stokes shift.
Figur 3: Generelt absorpsjons- og emisjonsspektere. Emisjonsspekteret er forskjøvet mot høyere
bølgelengder i forhold til absorpsjonsspekteret. Denne forskyvningen betegnes Stokes shift.
Bruk av fluorescens i biologien
En rekke cellulære bestandeler og funksjoner kan studeres kvalitativt og kvantitativt ved å binde
fluorescerende fargestoff såkalte fluorokromer til de cellulære parametrene en ønsker å studere. I
tabell 1 er de vanligste fluorokromer og de cellulære parametrene de binder seg til angitt.
Fluorokromene har en høy spesifisitet/affinitet for ulike komponenter i cellen (DNA, RNA,
proteiner). Ved bruk av monoklonale antistoffer som binder seg til spesifikke proteiner, kan disse
spesifikke proteinene lokaliseres og kvantifiseres. Fluorescensen fra er fluorokrom kan avhenge av
egenskaper i det omkringliggende miljø som temperatur, pH, Ca 2+ og nærvær av andre
fluorokromer. Dette kan benyttes til å studere funksjonelle parametre som for eksempel pH og
Ca 2+ -fluks. Fluorescens mikroskopi benyttes både til å lokalisere og kvantifisere fluorescens i vev
og intracellulært.
Tabell1: De vanligste cellulære komponenter og funksjoner som kan måles ved fluorescens
Cellulære komponenter Fargestoff
DNA Hoechst, propidium iodide, mithramycin, DAPI m fl
S-fase celler BrdU/Hoechst, anti-Brdu antistoff
Kromosomer Hoechst, cromocyanine A3
Spesifikke kromosom-regioner In situ hybridisering –fluorescein isothiocyanate (FITC)
Kromatin struktur Acridin orange, 7-aminoactinmycin
RNA Propidium iodide, acridine orange
Mitochondria Rodamine
Protein Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Spesifikke proteiner:
Overflate proteiner og reseptorer
Cytoplasmatisk proteiner
Cytoskjelettet
Kjerneproteiner
Oncogenprodukter
Cellulær funksjoner
Enzymaktiviteter Finnes en rekke fargestoffer
Ionefluks:
Ca 2+
furo-3, indo-1
Mg 2+
Monoklonale antistoffer evt andre prober (f.eks phalloidin mot
aktin) konjugert til ulike fargestoffer som:
FITC/phycoerythrin/Alexa/Texas red/allophycocyanine/ Cy5/ mfl.,
mag-indo-1
pH Dicyano-hydroquinone
Membran potensial Cyanine fargestopffer: oxonol
Membran fluiditet Fluorescens polarisasjon av lipid probe
4

Fag SIF 4070 Cellebiologi, vår2001 Labøving nr. 3: Fluorescensmikroskopi
En rekke intracellulære molekyler er fluorescerende i seg selv. Denne fluorescensen betegnes
egenfluorescens eller autofluorerscens. Den kraftige røde fluorescensen fra klorofyll i planteceller
er et eksempel.
I tillegg til fluorescensmikroskopi er det to andre metoder for måling av fluorescens. Flow
cytometri (laboratorieøving 6) måler kvantitativ fluorescens per celle. Spektrofluorometri måler
gjennomsnittlig fluorescens i prøven.
Fluorescensmikroskopi
Fluorescensmikroskopet avbilder de fluorescerende deler av objektet. Det finnes to typer av
fluorescensmikroskop, bestemt av fra hvilken retning objektet belyses. Ved transmisjonslys belyses
objektet som i helfelt mikroskop, som vist i figur 4 A. Problemet med denne formen for
fluorescensmikroskopi er at intensiteten av det eksiterende lyset er mye høyere enn av fluorescens
lyset, og god avbilding er avhengig av meget høy kvalitet på de filterene som benyttes for at ikke
eksitasjonslyset skal avbildes. For å redusere intensiteten av eksitasjonslyset som når bildeplanet
benyttes en mørkefeltkondensor (jfr laboratorieøving 1). Dette øker kontrasten i fluorescensbildet,
men mørkefeltet reduserer kondensorens effektive numeriske apertur (NA) samtidig som
objektivets numeriske apertur må være mindre enn den numeriske aperturen for mørkefelt. Da
fluorescensintensiteten er proporsjonal med intensiteten av eksitasjonslyset som igjen er
proporsjonal med NAkond 2 samt at fluorescensintensiteten i bildet er proporsjonal med NAobj 2 , vil
den totale intensiteten i fluorerscensbildet bli redusert i betydelig grad.
A
B
Figur 4: Skjematisk framstilling av fluorescens mikroskop.
A) Transmisjonslys mikroskop der den heltrukne linjen markerer eksitasjonslyset og den stiplete
linjen fluorescenslyset.
B) Epibelysningsmikroskop der eksitasjonslyset er markert. Et dikromatisk filter med en
karakteristisk bølgelende reflekterer lys under denne bølgelengden
C) Epibelysningsmikroskop der emisjonslyset er markert. Det dikromatiske filteret som reflekterte
eksitasjonslyset slipper gjennom det mer langbølgdede emisjonslyset .
Pålys eller epibelysning mikroskopi har nå erstattet den tidligere transmisjonslys-formen for
mikroskopi. Ved epibelysning belyses objektet gjennom objektivet idet objektivet også fungerer
som kondensor (figur 4 B,C). Eksitasjonslys og fluorescens separeres ved hjelp av dikromatiske
speil og filtere. Fordeler med epibelysning er at det ikke stilles så store krav til filtrene fordi
intensiteten av det tilbakespredte lyset fra objektet er langt mindre enn intensiteten av
5
C

Fag SIF 4070 Cellebiologi, vår2001 Labøving nr. 3: Fluorescensmikroskopi
Lyskilde,
gjennomlys
Kondensor
Objektiv
Lyskilde,
Kvikksølvlampe
epiilluminering
Holder for
filterkuber
CCD kamera
Fig. 5. Olympus omvendt mikroskop
eksitasjonslyset ved transmisjonslys mikroskopi. En annen fordel er at belysningsfelt og bildefelt
har felles optisk akse som forenkler innstilling av mikroskopet. Da objektivet fungerer som
kondensor vil fluorescensintensiteten i bildet være proporsjonal med NAobj 4 . Det er derfor viktig å
bruke objektiv med høy numerisk apertur. Figur 5 viser skjematisk lysgangen gjennom et Olympus
omvendt mikroskop tilsvarende det Nikon mikroskopet som skal benyttes i laboratorieoppgaven.
6
Okular
Kamera
Fokusering

Fag SIF 4070 Cellebiologi, vår2001 Labøving nr. 3: Fluorescensmikroskopi
Fluorescensintensiteten er ideelt sett proporsjonal med mengde fluorescerende molekyler i objektet.
Ved å detektere fluorescensen med fotomultiplikatorrør eller CCD kamera kan en derfor utføre
kvantitative målinger av fluorescensen og dermed fluorokromen og den komponenten i cellen den
er bundet til. Slik kvantifisering forutsetter at fluorokromene ikke ødelegges av eksitasjonslyset
(såkalt bleking) og at eksitasjonslyset og fluorescenslyset ikke dempes gjennom objektet. Det siste
vil forkomme i tykke preparater fordi lyset blir spredt og absorbert av preparatet. Det må derfor
korrigeres for disse feilene ved kvantitativ fluorescensmikroskopi.
Eksitasjonslyset ved fluorescensmikroskopi er høytrykks kortbuelamper som har meget høy
lystetthet i lysbuen. Lampene er fylt med Hg eller Xe som har et eksitasjonsspekter med en rekke
eksitasjonstopper i UV og det synlige spektral området. Bruk av filtere sørger for at eksitasjonslyset
har riktig bølgelengde, og at tilhørende fluorescens detekteres.
Konfokal laser scanning mikroskopi (KLSM)
Ved tradisjonell fluorescensmikroskopi vil bilde av et objekt med tykkelse større enn mikroskopets
dybdeskarphet ha bidrag fra lys også fra områdene over og under objektplanet dvs det plan som
avbildes skarpt. Disse bidragene reduserer kontrasten i bildet vesentlig. Med konfokal mikroskopi
reduseres disse bidragene sterkt ved å plassere en feltblender foran fluorescensdetektoren.
En prinsippskisse av lysgangen i et KLSM er vist i figur 6 A. En kondensor C avbilder en
punktkilde (A) (punktkilden er vanligvis laserlys) til et fokus (D) i objektet (S). Objektet blir så
avbildet skarpt via objektivet (O) til en feltblender (B) foran fotomultiplikatorrøret som benyttes
som fluorescens detektor. En sier at B er konfokal med A og D siden avbildingen av A og
tilbakeprojeksjonen av B har samme fokus i objektet. Avbildingen av en punktkilde fører til at kun
fokus (D) blir belyst med høy intensitet. Lysintensiteten avtar raskt utenfor fokus. Feltblenderen
foran fotomultiplikatorrøret forhindrer at lys fra punkt utenfor fokus både i aksial og lateral retning
når detektoren (Figur 6 B). Blokkering av lys utenfor fokus gir en radikal forbedring av kontrasten
i bildet og dermed også bildets kvalitet og tolkbarhet.
A B
Figur 6: Lysgangen i et konfokalt mikroskop. A) Prinsippskisse av lysgangen i et konfokalt
mikroskop. B) Lys utenfor fokalplanet (4) kan ikke passere gjennomblenderåpningen (7) og når
ikke detektoren (6).
7

Fag SIF 4070 Cellebiologi, vår2001 Labøving nr. 3: Fluorescensmikroskopi
Oppbyggingen og lysgangen av et epifluorescens KLSM som skal benyttes i denne oppgaven er
vist i figur 6B. En laserstråle passerer et scanner system, linser (1) og når objektivet=kondensor (2)
som fokuserer lyset på objektet (3). Fluorescenslyset samles opp av objektivet og når et
dikromatisk speil (5) som reflekterer fluorescenslyset (lys over en bølgelengde karakteristisk for det
dikromatiske speilet) inn på ett fotomultiplikatorrør fungerer som detektor. Foran detektoren sitter
en blender (7) som kun slipper gjennom lys fra fokalplanet (4).
Konfokalmikroskopi avbilder kun ett punkt om gangen. For å avbilde et plan må fokus flyttes
relativt til prøven. Dette gjøres vanligvis ved å scanne laserlyset over objektet. Laserlyset scannes
ved bruk av et vibrerende speil.
Ved å flytte fokalplanet aksialt kan en foreta optisk snitting. Dette er en av de store fordelene
KLSM har, idet en kan avbilde tykke preparat med tynne 2-dimensjonale snitt i ulike dybder i
preparatet i en serie av bilder. Disse bildene kan settes sammen til en 3-dimensjonal avbilding av
objektet.
Figur 7: Optisk snitting av et tykt preparat der snitt i ulike dybder avbildes ved konfokal laser
scanning mikroskopi
Som nevnt benyttes fotomultiplikatorrør som fluorescens detektor ved KLSM, idet en
punktdetektor må benyttes. CCD kamera brukes ved tradisjonell fluorescens mikroskopi.
8

Fag SIF 4070 Cellebiologi, vår2001 Labøving nr. 3: Fluorescensmikroskopi
Gjennomføring av oppgaven
A. Fluorescens merking av celler
Osteosarcomcellelinjen (OHS) gror på spesielle objektglass.
Objektglasset har 4 brønner som skal farges på 4 ulike måter:
a) med det fluorescerende fargestoffet propidium iodide som binder seg til DNA og RNA
b) med phalloidin som binder seg til aktin-filamenter. Phalloidin er merket med fluorokromet
Alexa488.
c) med en kombinasjon av propidium iodide og phalloidin-Alexa488
d) ufarget for å detektere cellens egenfluorescens
Absorpsjons- og fluorerscensspektrene for Alexa488 og propidium iodide er vist i figur 8.
A
Figur 8: Absorpsjon- og fluorescens spektra for A) Alexa488 og B) propidium iodide
Prosedyre for merking av cellene med Phalloidin Alexa 488 og propidium iodide
Alexa 488 Phalloidin er et derivat som brukes til spesifikk merking av fibrillært actin. Phalloidin er
en phallotoxin, isolert fra soppen Amanita phalloides. Dette toksinet har LD50 = 2 mg/kg når det ble
injisert i mus. Mengdene som brukes i forbindelse med denne lab. øvingen er imidlertid svært liten
(se Molecular Probes hjemmeside, www.probes.com). Bruk hansker.
Stamløsning: 200 enheter/mL Alexa 488 Phalloidin i methanol (oppbevares ved -20 °C)
1. Skyll cellene som gror i brønnene på objektglasset to ganger med 500μl forvarmet PBS, pH 7.4
(PBS: phosphate - buffered saline)
2. Fikser cellene i 500μl 4 % formaldehyde i PBS med 2% sukrose i 10 min ved romtemperatur
3. Skyll cellene en gang med 500μl PBS.
4. Permeabiliser plasmamembranen ved å tilsette 500μl HEPES-triton buffer i 5 min. Bufferen
består av 20 mM HEPES, 300 mM sukrose, 3 mM MgCl2, 50 mM NaCl, og 0.5% Triton x-100.
5. Farg aktin i cellene ved å tilsette 500 μl Alexa 488 til de to brønnene der aktinfilamentet skal
farges. Stamløsningen av Alexa488 Phalloidin er fortynnet 40 x i PBS tilsatt 1% bovint serum
albumin. Inkuber i 20 min ved romtemperatur. Dekk til slik at fordamping minimaliseres.
6. Til brønnene som ikke skal farges med Alexa488Phalloidin tilsettes 500μl PBS med 1% bovint
serum albumin.
7. Skyll to ganger med 500μl PBS.
8. Fjern RNA da propidium iodide også binder seg til RNA, ved å tilsette 500μl 100 μg/ml RNase.
Inkuberes i 30 min ved romtemperatur
9
B

Fag SIF 4070 Cellebiologi, vår2001 Labøving nr. 3: Fluorescensmikroskopi
9. Skyll en gang med 500 μl PBS
10. Farg DNA ved å tilsette 500 μl propiudium iodide til de to brønnene med celler som skal farges
med både Alexa og propidium iodide, og kun propidium iodide. Inkuber i 15 min.
11. Skyll med 500μl PBS 2 ganger.
12. Monter objektglasset ved å tilsette en dråpe Vektashield. Dette er et monteringsmiddel tilsatt et
stoff som skal redusere blekingen (ødeleggelse) av fluorokromene.
B. Demonstrasjon av ulike fargede preparat
Fluorescens og konfokal laser scanning mikroskopet vil bli gjennomgått. Ulike preparat vil bli
demonstrert:
- DNA og reparasjonsenzymet Uracil-DNA glycosylase i kjernen og i mitokondria
- plasmamembranproteiner
- penetrasjon av antistoffer i multicellulære sfæroider
- collagen og hyaluronsyre i ekstracellulær matrix
- aktinfilament og fokalpunkter
- endotelceller som danner blodåreveggen i vev
C. Mikroskopering av fargede celler
1. Gjør deg kjent med mikroskopet, og finn de ulike delene som benyttes ved innstilling for
gjennomlys, fluorescensmikroskopi, og konfokal laser scanning mikroskopi. Benytt 60 x
oljeimmersjonsobjektiv
2. Sett inn filterblokker som eksiterer og detekterer hhv Alexa488 og propidium iodide foran
fotomultiplikatorørene (figur 9). Benytt filterblokkene BHS: eksitasjon 488 nm, dikromatisk
filter 510 nm, langpass filter 515 nm og A2 som separerer fluorescenslyset inn på de to
fotomultiplikatorene: dikromatisk filter 565 nm, langpassfilter 600nm foran PMT1 og
båndpassfilter BP525-555 foran PMT2. Sjekk hvordan det passer med absorpsjons- og
emisjonsspektrene for fargestoffene.
PMT 2
Alexa
Argon laser
488nm
514 nm
BP
525-555
PMT1
Propidium
iodide
10
LP 600 nm
Dicromatisk filter 565 nm
LP 515 nm
Dicromatisk filter 510 nm
Prøve
Figur 9: Filter for
eksitasjon og emisjon av
propidium iodide og
Alexa488Phalloidin

Fag SIF 4070 Cellebiologi, vår2001 Labøving nr. 3: Fluorescensmikroskopi
3. Gjør deg kjent med programmet COMOS som skal benyttes for å ta bilder.
4. Fokuser på celler med gjennomlys. Innstill spenningen over fotomultiplikatorrørene (gain) slik
at hele gråtoneskalaen blir utnyttet (ønsker ikke metning av fluorescensintensiteten). Benytt så
lav åpning på blenderen foran detektorene som praktisk mulig for å få et godt fluorescenssignal.
Innstillingen for PMT1 bestemmes ved å benytte cellene farget med bare propidium iodide.
Innstillingen for PMT2 bestemmes ved å benytte cellene farget med bare Alexa488Phalloidin.
5. Ta bilder av celler i alle fire brønnene. Benytt innstillingen bestemt over. Juster z-posisjon
(langs optisk akse/dybde i cellen) for å få optimalt bilde.
6. Lagre bildene på harddisken C:\COMOS\cellebio\
D. Bildeanalyse
1. Linjeprofil som angir fluorescens intensitet som funksjon av diameter i cellen framstilles med
programvaren COMOS. Bruk komandoene: Enhance. Length\profile
2. Histogram som angir antall pixler som funksjon av fluorescensintensitet framstilles med
programvaren COMOS. Bruk komandoene: Enhance. Histogram
3. Skriv ut bilder av celler farget med 1) bare phalloidin Alexa488, 2) bare propidium iodide, 3)
begge fargestoffene. Benytt et bildeanalyseprogram for eksempel Adobe photoshop,
PhotoPaint, eller et annet bildeanalyseprogram dere har tilgang til. Hvis dere velger Adobe
photoshop er framgangsmåten:
a) åpne filene med format pic med kommandoen Open as….
Angi og file format: RAW
Raw optins:
Width 768, Hight 512, Channel 1, Header 76. 8 bit
Specified image is smaller than file. Open anyway? Yes
b) Legg farge på bildet
Bruk kommandoen Image. Mode. RGB color
Legg først farge på aktinbildet. Markere dette bildet ved å bruke knappen markert med rektangel
(rectangular marquee tool) øverst til venstre. Legg på farge ved funkjonene:
Image. Adjust Color balance (velg f.eks rødt for aktin, og grønt for DNA)
Image Adjust Brightness/contrast (juster nå fargen og kontrasten i bildene)
Image. Adjust Hue/Saturation
Legg deretter farge på DNA bildet på samme måten.
c) Legg aktin og DNA fargede bilder oppå hverandre
Se under help: copying selections or layers. To pase one selection into another
Kort fortalt gjøre det slik:
- Marker Alexa488cellene du vil kopiere. Bruk knappen markert med rektangel (rectangular
marquee tool) øverst til venstre
- Klikk copy
- Gå til bilde av propidium iodide farget celler
- Klikk Edit. Paste into (NB bruk paste into, ikke bare paste)
- Nå vil propidium iodide farget celle ligge oppå Alexa488 farget og skjule denne.
11

Fag SIF 4070 Cellebiologi, vår2001 Labøving nr. 3: Fluorescensmikroskopi
- Klikk Layers ”palette” (til høyre) og klikk Opacity. Juster Opacity inntil du ser begge fargene
slik du synes er best.
- Dersom ikke de to cellene ligger helt oppå hverandre justeres det med knappen markert med
kors (move tool)øverst til høyre i panelet til venstre.
RAPPORT
1. Skriv ut bilder av celler kun farget med 1) bare phalloidin Alexa488, 2)bare propidium iodide,
og 3) begge fargestoffene. Beskriv fargingen av cellene.
2. Beskriv en linjeprofil (fluorescensintensitet som funksjon av diameter i cellen) for celler farget
med 1) phalloidin Alexa488 og 2) propidium iodide . Lag en skisse
3. Beskriv et histogram (antall pixler som funksjon av fluorescensintensitet) for celler farget med
1) phalloidin Alexa488 og 2) propidium iodide. Lag en skisse
4. Ble phalloidin Alexa488 detektert i fotomultiplikatoren for propidium iodide og vice versa?
Diskuter hva dette eventuelt kan skyldes.
5. Anta at dere skal benytte fargestoffet Hoechst33258 for å farge DNA, kombinert med Alexa488
phalloidin for å farge fibillært aktin. Angi hvilke laserbølgelengder dere vil benytte for å
eksitere de to fargestoffene, og med hvilke filtere emisjonspekterene skal separeres. Velg
eksitasjonsbølgelengder og emisjonsfiltere uavhengig av hva som er tilgjengelig på
konfokalmikroskopet dere brukte. Benytt nettsiden til firmaet Molecular Probes:
http://www.probes.com/ for få nødvendig informasjon om eksitasjon og emisjon av fargestoffet
Hoechst33258. Lag en skisse som viser filterkombinasjonen tilsvarende som figur 9.
Rapporten kan skrives av to og to eller hele gruppen på 6, avhengig av hva som er mest praktisk.
12