fluorobeads t and fluorobeads t developer ... - One Lambda
fluorobeads t and fluorobeads t developer ... - One Lambda
fluorobeads t and fluorobeads t developer ... - One Lambda
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA 91303-2801 USA Telf. +1 (818) 702-0042 Faks: +1 (818) 702-6904 www.onelambda.com<br />
PRODUKTVEDLEGG<br />
FLUOROBEADS ® -T AND FLUOROBEADS ® -T DEVELOPER<br />
[FLUOROBEADS ® -T OG FLUOROBEADS ® -T-FREMKALLER]<br />
Katalognr. FB1-25, FB1-100 og FB1-DEV<br />
Til generell laboratoriebruk.<br />
TILTENKT BRUK<br />
FluoroBeads ® -T gir en enkel prosedyre for isolasjonen av T-lymfocytter til bruk i HLA klasse I typebestemmelsesanalyser som<br />
bruker fluorescente fargestoffer. FluoroBeads ® -T-fremkaller er spesielt utviklet til å bli brukt i FluoroBeads ® -T isolasjonsmetoden.<br />
SAMMENDRAG OG FORKLARING<br />
FluoroBead ® -T er immunomagnestisk perler som er mindre enn 1 mikron i diameter. Anti-CD2 monoklonale antistoffer koplet<br />
spesielt til perleoverflaten binder til E-rosettmottakeren på T-lymfocytter. FluoroBeads ® -T gir brukeren en rask metode til å<br />
separere T-lymfocytt/FluoroBeads ® -T komplekser fra blod med bruken av en innsamlermagnet. FluoroBeads ® -T metoden trenger<br />
ingen kalde inkubasjoner, roteringer eller sentrifugering. FluoroBeads ® -T fremkaller er en reagens spesielt utviklet til å forbedre<br />
ytelsen av FluoroBeads ® -T immunomagnetiske perler.<br />
PRINSIPP<br />
Immunomagnetiske perler er superparamagnetiske partikler med monoklonale antistoffer koplet til overflatene sine. Perlene kan<br />
innsamles ved bruk av et magnetisk felt. Når det magnetiske feltet blir fjernet, beholder perlene ingen gjenværende magnetisme.<br />
De kan bli magnetisert og gjendispergert gjentatte ganger. Spesifisiteten til det koplede monoklonale antistoffet avgjør typen celler<br />
som blir innsamlet.<br />
REAGENSER<br />
A. Identifikasjon<br />
FluoroNeads ® er superparamagnetiske partikler koplet til monoklonale antistoffer og suspendert i PBS med stabilisatorer og<br />
natriumazid som et konverseringsmiddel. Det monoklonale antistoffet er av murin opprinnelse. FluoroBeads-fremkalleren<br />
inneholder ikke-toksiske proprietære ingredienser.<br />
B. Advarsler eller forsiktighetsregler<br />
1. ADVARSEL: Alle blodprodukter bør bli beh<strong>and</strong>let som mulig smittsomme. Kildemateriale som dette produktet ble<br />
avledet fra, ble funnet å være negativt da det ble testet med gjeldende FDA-påbudte tester. Ingen kjente testmetoder kan gi<br />
forsikring om at produkter avledet fra humant blod ikke vil overføre smittsomme sykdommer.<br />
2. ADVARSEL: Denne reagensen inneholder 0,01 % natriumazid som under syreholdige forhold avgir hydrazonsyre, en<br />
ekstremt toksisk sammensetning. Reagenser som inneholder natriumazid bør bli uttynnet i rennende vann før de blir kastet.<br />
Disse forholdene er anbefalt for å unngå at de blir kastet i avløpsrør hvor det kan utvikles eksplosive forhold.<br />
3. FORSIKTIG: Ikke bruk lithiumheparin eller EDTA som en antikoagulant for blodprøven din.<br />
4. Se sikkerhetsdatabladet for detaljert informasjon.<br />
C. Bruksanvisning<br />
Se BRUKSANVISNING på side 3.<br />
D. Oppbevaringsinstruksjoner<br />
Oppbevar reagenser ved temperaturen angitt på pakken. Bruk før den trykte utløpsdatoen.<br />
E. Rensing eller beh<strong>and</strong>ling er nødvendig for bruk<br />
FluoroBeads ® -T: Resuspender før bruk ved å virvle i 10 sekunder.<br />
Fremkaller: Fortynn én del (10X) lageroppløsning til ni deler 1X PBS uten Ca ++ og Mg ++ salter. Oppbevar ved 2 - 5 ºC.<br />
F. Indikasjoner på ustabilitet<br />
FluoroBeads ® -T: Ikke bruk hvis perlene har klumpet seg. Alvorlig klumping av perlene kan indikere forringelse av produktet.<br />
Fremkaller: 10X fremkaller bør være en lett farget, klar oppløsning. Dannelse av bunnfall kan indikere ustabilitet eller<br />
bakteriekontaminering.<br />
FB-TDEV-PI-NO-00, Rev 7 Side 1 av 4
PRØVEINNSAMLING OG FORBEREDELSE<br />
Ta ca. 10 ml helblod. Den foretrukne antikoagulanten er ACD eller CPDA. Ikke bruk lithiumheparin! T-celler bør bli isolert innen<br />
24 timer for å oppnå den høyeste ytelsen. Blod opptil 3 dager gammelt kan imidlertid brukes. Oppbevar blodprøven horisontalt ved<br />
romtemperatur ( 20 - 25 ºC).<br />
PROSEDYRE<br />
A. Materialer som følger med<br />
1. FluoroBeads ® -T<br />
2. Instruksjoner for celleisolasjon og -testing<br />
3. FluoroBeads ® -T fremkaller (10X). Se ”Rensing eller beh<strong>and</strong>ling som er nødvendig for bruk” for 1X-instruksjoner.<br />
B. Materialer som er nødvendige, men som ikke følger med<br />
1. Klasse I-vevbestemmelsesbrett (<strong>One</strong> <strong>Lambda</strong> eller tilsvarende)<br />
2. 5 ml og 1,5 ml plast- eller glass-sentrifugerør med korker<br />
3. Fosfatbufret saltoppløsning (PBS) uten Ca ++ og Mg ++ salter (f.eks. Irvine Scientific Kat. #9242)<br />
4. McCoys middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS<br />
5. Magnetisk separator (<strong>One</strong> <strong>Lambda</strong> eller tilsvarende)<br />
6. Aspirator eller pipetter til engangsbruk<br />
7. Varm uaktivert fetalt kalveserum (HIFCS)<br />
a) Stamoppløsning: Varm FCS ved 56 ºC i 30 minutter for å inaktivere komplement. Oppbevar ved 2 - 5 ºC eller<br />
alikvoter og frys ved -20 ºC.<br />
b) Arbeidsoppløsninger: Tilsett 5 ml HIFCS lageroppløsning til 95 ml med McCoys middek eller tilsvarende.<br />
C. Valgfrie materialer/følger ikke med<br />
1. Ficoll-Hypaque<br />
2. Percoll<br />
a) Stamoppløsning (Percoll-X) Kombiner 1 del med 10X FBS og 9 deler Percoll.<br />
b) Arbeidsoppløsning (50 % Percoll): Bl<strong>and</strong> like deler av Percoll-X og PBS.<br />
3. Stain/Quench-reagenser<br />
a) Akridin oransje/etidiumbrimid FluoroQuench (OLI kat. nr. FQAE500) eller<br />
b) Etidiumbromid FluoroQuench (OLI kat. nr. FQEB500) eller<br />
c) Tilsett 1 ml EB-stamoppløsning til 9 ml hemoglobin eller 1 % blekk (Se Materialer nr. 11 - 14)<br />
4. Hemoglobin: Oppløs 10 g hemoglobin i 90 ml 5 % EDTA/PBS. Bring volum til 99 ml. Tilsett 1 ml med 1 % natriumazid.<br />
Sentrifuger ved 1000 g i 45 minutter. Oppbevar supernatant ved -20 ºC.<br />
5. Blekk: Oppløs 1 g okse serumalbumin (BSA) i 10 ml 5 % EDTA/PBS, tilsett 0,1 m l % natriumazid og 0,1 ml Higgins<br />
svart kalligrafiblekk<br />
6. 1 % natriumazid: Oppløs 1 g natriumazid i 100 ml PBS.<br />
Forsiktig: Natriumazid er toksisk. Bruk alltid verneutstyr når du håndterer natriumazid.<br />
7. 5 % dinatrium etylendiamin-tetrasur syre (EDTA)/PBS: Tilsett 5 g EDTA i 90 ml PBS. Juster pH til 7,2 med 10 M NaOH<br />
for å oppløse EDTA. Bring volum til 100 ml med PBS.<br />
8. Etidiumbromid (stamoppløsning): Oppløs 50 mg i 1 ml destillert vann. Tilsett 49 ml PBS. Varm i vannbad ved 56 ºC i 30<br />
min. Alikvoter og frys ved -20 ºC.<br />
9. Karboksyfluorescein diacetat (CFDA):<br />
a) Stam-CFDAoppløsning: Oppløs 10 mg CFDA i 1 ml aceton et glassrør. Oppbevar ved -20 ºC. Oppbevar i mørke.<br />
b) Arbeidsoppløsninger: Bruk en av de følgende:<br />
Forberedt i PBS ved pH 7,2: Tilsett 30 μl CFDA lageroppløsning til 5 ml PBS (pH 7,2). Oppbevar ved 2 - 5 ºC i<br />
opptil en uke.<br />
Forberedt i PBS ved pH 5,5: Tilsett 30 μl CFDA lageroppløsning til 5 ml PBS (pH 5,5). Oppbevar ved 2 - 5 ºC i<br />
opptil 1 uke.<br />
D. Trinn-for-trinnprosedyre.<br />
Se BRUKSANVISNING på side 3.<br />
BRUKSANVISNING<br />
ISOLASJONSTEKNIKKER<br />
A. Isolasjon fra helblod<br />
1. Dispenser 2 ml blod inn i et 5 ml rør.<br />
2. Resuspender FluoroBeads ® -T grundig før bruk. Virvle i ca. 10 sekunder<br />
3. Tilsett 100 μl FluoroBeads ® -T til blodprøven. Kork umiddelbart røret og snu det opp ned 2 til 3 ganger for å dispergere<br />
magnetisk perler.<br />
4. Roter røret én gang per sekund i 3 minutter ved 20 - 25 ºC for å tillate binding av perler til T-celler. Må ikke overstige 4<br />
minutter. Bruk et ende-over-ende roteringsutstyr eller bl<strong>and</strong> med hånd.<br />
FB-TDEV-PI-NO-00, Rev 7 Side 2 av 4
5. Tilsett 2 ml med 1X fremkaller (se instruksjonene for ”Beh<strong>and</strong>ling som er nødvendig til bruk” ovenfor. Kort røret og snu<br />
det opp ned 2 – 3 ganger for å bl<strong>and</strong>e. Dette er et høyst viktig trinn!<br />
6. Ta av korken og plasser røret i en magnetisk separator i 3 hele minutter.<br />
7. Fjern og kast supernatant med en pipette til engangsbruk. Fjern røret fra magneten.<br />
8. Resuspender celler (perler) med 1 – 2 ml PBS. Snu forsiktig røret med en rask bevegelse for å dispergere perlene. Sett<br />
røret tilbake i den magnetiske separatoren i 1 minutt. Fjern og kast supernatant. Gjenta to ganger.<br />
9. Fortsett til ”Merking og cellekonsentrasjonsprosedyrer” (nedenfor) eller resuspender celler (perler) i 0,5 ml med McCoys<br />
middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS.<br />
B. Isolasjon fra Ficoll-grensesnitt<br />
1. Sentrifuger sitrert eller heparinisert blod i 10 minutter ved 400 - 900 g.<br />
2. Innsamle Buffy Coat og fortynn med et likt volum med PBS. Bl<strong>and</strong> godt.<br />
3. Legg et lag av maks. 2 ml Buffy Coat/PBS-bl<strong>and</strong>ing over 1,5 ml med Ficoll-Hypaque [Tetthet (D) = 1,077] i 5 ml rør og<br />
sentrifuger i 10 minutter ved 1000 g.<br />
4. Innsamle ca. 1 ml av grensesnitt fra hvert rør og overfør til et sentrifugerør. Sentrifuger i 1,5 minutter ved 3000 g eller 10<br />
minutter ved 1000 g.<br />
5. Kast supernatant og resuspender pellet i PBS. Sentrifuger i 5 minutter ved 1000 g (fjern majoriteten av blodplater).<br />
6. Kast supernatant med pipetter til engangsbruk. Resuspender pellet i 1 ml med 20 % HIFCS/PBS.<br />
7. Dispenser 100 μl med FluorBeads ® -T til prøverøret og kork røret.<br />
8. Roter prøven i 3 minutter ved 20 - 25 ºC.<br />
9. Ta av korken og plasser røret i en magnetisk separator i 1 minutt.<br />
10. Fjern og ta vare på supernatant i et annert rør til B-lymfocyttisolasjon med FluoroBeads ® -B.<br />
11. Resuspender perler/celler i 1 ml 20 % HIFCS/PBS. Snu forsiktig røret med en rask bevegelse for å resuspendere perlene.<br />
Plasser i en magnetisk separator i 30 sekunder. Kast supernatant med en pipette til engangsbruk. Gjenta 2 ganger.<br />
12. Fortsett til ”Merking og cellekonsentrasjonsprosedyrer” (nedenfor) eller resuspender celler (perler) i 0,5 ml med McCoys<br />
middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS.<br />
C. Isolasjon fra frossent Ficoll-grensesnitt<br />
1. Tin hele celler ved 56 ºC (DMSO -fjerning er ikke nødvendig).<br />
2. Legg et lag av 0,5 ml cellesuspensjon over 0,5 ml med 50 % Percoll i et 1,5 ml sentrifugerør.<br />
3. Sentrifuger ved 2000 g i 2 minutter eller ved 400 g i 10 minutter<br />
4. Kast supernatant med pipetter til engangsbruk.<br />
5. Resuspender celler i 1 ml 20 % HIFCS/PBS.<br />
6. Dispenser 100 μl med FluoroBeads ® -T til prøverøret og kork røret.<br />
7. Roter prøven i 3 minutter ved 20 - 25 ºC.<br />
8. Ta av korken og plasser røret i en magnetisk separator i 1 minutter.<br />
9. Fjern supernatant til et annet sentrifugerør til B-lymfocyttisolasjon med FluoroBeads ® -B.<br />
10. Resuspender de resterende perler/celler i 1 ml 20 % HIFCS/PBS. Snu forsiktig røret med en rask bevegelse for å<br />
resuspendere perlene og plasser på en magnetisk separator i 30 sekunder. Kast supernatant ved bruk av pipetter til<br />
engangsbruk. Gjenta to ganger.<br />
11. Fortsett til ”Merking og cellekonsentrasjonsprosedyrer” (nedenfor) eller resuspender celler (perler) i 0,5 ml med McCoys<br />
middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS.<br />
MERKING OG CELLEKONSENTRASJONSPROSEDYRER<br />
A. CFDA-metode<br />
1. Ta av korken og plasser røret i en magnetisk separator i 1 minutter. Fjern supernatant. Vask celler (perler) to ganger med<br />
PBS.<br />
2. Tilsett 0,5 ml med CFDA (arbeidsoppløsning, pH 5,5) og bl<strong>and</strong>.<br />
3. Inkuber røret horisontalt i mørke i 10 minutter ved 20 til 25 ºC.<br />
4. Separer magnetisk (som beskrevet ovenfor) og vask celler to ganger med PBS.<br />
5. Resuspender celler i 0,5 ml McCoys middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS<br />
6. Tilsett 1 μl cellesuspensjon til en tom brønn på et Terasaki-brett. Kontroller celletall med et fluorescent mikroskop. Juster<br />
konsentrasjonene til 2 x 10 6 /ml (2.000 celler per brønn).<br />
7. Prøver kan bli overført til 1,5 ml rør og oppbevart horisontalt ved 2 º til 5 ºC opptil 2 dager før testing.<br />
B. FQAE-metode<br />
1. Tilsett 1 μl celler (perler) til en tom brønn på et Terasaki-brett.<br />
2. Tilsett 5 μl FQAE (OLI Kat. nr. FQAE 500) til brønnen..<br />
3. Kontroller celletall med et fluorescent mikroskop. Juster konsentrasjonene til 2 x 10 6 /ml (2.000 celler per brønn).<br />
4. Prøver kan bli overført til 1,5 ml rør og oppbevart horisontalt ved 2 til 5 ºC opptil 2 dager før testing.<br />
FB-TDEV-PI-NO-00, Rev 7 Side 3 av 4
ABC-TYPEBESTEMMELSE<br />
A. CFDA-metode<br />
1. Bl<strong>and</strong> celleforberedelsen ved å banke lett på pellet og å snu røret opp ned. Ikke bl<strong>and</strong> med en sprøyte. Tilsett 1 μl CFDAmerkede<br />
celler (perler) til hver brønn av et HLA klasse II typebestemmelsesbrett.<br />
2. Inkuber i mørke i 30 minutter ved 20 - 25 ºC. (For OLI LMT, inkubere i 60 minutter ved 20 - 25 ºC og fortsett til<br />
trinn nr. 5).<br />
3. Tilsett 5 μl ABC-kaninkomplement til hver brønn.<br />
4. Inkuber brettet horisontalt i mørke i 1 minutter ved 20 til 25 ºC.<br />
5. For hver brønn tilsett 5 μl av én av de følgende ingrediensene.<br />
a) FluoroQuench etidiumbromid (OLI Kat. nr. FQEB500) eller<br />
b) EB/hemoglobin arbeidsoppløsning eller<br />
c) EB/1 % blekk arbeidsoppløsning.<br />
6. Brett kan bli avlest umiddelbart eller kan bli oppbevart i mørke ved 2 til 5 ºC i opptil 2 dager.<br />
B. FQAE-metode<br />
1. Bl<strong>and</strong> celleforberedelsen ved å banke lett på pellet og å snu røret opp ned. Ikke bl<strong>and</strong> med en sprøyte. Tilsett 1 μl celler<br />
(perler) til hver brønn av et HLA klasse I typebestemmelsesbrett.<br />
2. Inkuber i mørke i 30 minutter ved 20 - 25 ºC. (For OLI LMT, inkubere i 60 minutter ved 20 - 25 ºC og fortsett til trinn<br />
nr. 5).<br />
3. Tilsett 5 μl kaninkomplement til hver brønn.<br />
4. Inkuber brettet horisontalt i mørke i 1 time ved 20 - 25 ºC.<br />
5. TiIsett 5 μl med FQAE til hver brønn.<br />
6. Brett kan bli avlest umiddelbart eller kan bli oppbevart i mørke ved 2 - 5 ºC i opptil 2 dager.<br />
PROSEDYRENS BEGRENSNINGER<br />
Celleytelsen vil variere med hver prøve avhengig av celletall og tiden siden blodtakingen. En rekke sykdommer kan forårsake en<br />
reduksjon i lymfocyttytelsen. Noen medikamenter kan også forårsake en reduksjon i lymfocyttytelser, og kan forårsake en<br />
reduksjon i HLA-antigenuttrykk. Prøver fra kadavre kan ha lave lymfocyttytelser med forhøyet monocytt og granulocyttkontaminering.<br />
Kontaminering med <strong>and</strong>re celler kan forårsake svake/falske negative reaksjoner. Monocytter har en variabel mengde med HLA<br />
klasse I- og klasse II-antigener. Blodplater har HLA klasse I-antigener og kan svekke antisera ved å absorbere antistoffene fra<br />
antisera.<br />
FORVENTEDE VERDIER<br />
FluoroBeads ® -T inneholder nok immunomagnestiske perler til å isolere mer enn 90 % av CD2+T-cellene i 1 ml med helblod.<br />
SPESIELLE PRESTASJONSKJENNETEGN<br />
Renheten til lymfocyttene som ble isolert, bør være over 90 %. Celler bør være reaktive med anti-HLA sera og bør bli lysert under<br />
st<strong>and</strong>ard analyseforhold for lymfocytttoksisitet.<br />
EUROPEISK AUTORISERT REPRESENTANT<br />
MDSS GMbH, Schiffgraben 41, D30175, Hannover, Tyskl<strong>and</strong><br />
REVISJONSHISTORIE<br />
Revisjon Dato Revisjonsbeskrivelse<br />
6 2007/04 Klarifiser hvilke antikoagulanter som ikke er akseptable Oppdater MDSS-adresse.<br />
7 2011/09 Fjernet katalog-ID FB1-40<br />
FB-TDEV-PI-NO-00, Rev 7 Side 4 av 4