fluorobeads t and fluorobeads t developer ... - One Lambda

21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA 91303-2801 USA Telf. +1 (818) 702-0042 Faks: +1 (818) 702-6904 www.onelambda.com
PRODUKTVEDLEGG
FLUOROBEADS ® -T AND FLUOROBEADS ® -T DEVELOPER
[FLUOROBEADS ® -T OG FLUOROBEADS ® -T-FREMKALLER]
Katalognr. FB1-25, FB1-100 og FB1-DEV
Til generell laboratoriebruk.
TILTENKT BRUK
FluoroBeads ® -T gir en enkel prosedyre for isolasjonen av T-lymfocytter til bruk i HLA klasse I typebestemmelsesanalyser som
bruker fluorescente fargestoffer. FluoroBeads ® -T-fremkaller er spesielt utviklet til å bli brukt i FluoroBeads ® -T isolasjonsmetoden.
SAMMENDRAG OG FORKLARING
FluoroBead ® -T er immunomagnestisk perler som er mindre enn 1 mikron i diameter. Anti-CD2 monoklonale antistoffer koplet
spesielt til perleoverflaten binder til E-rosettmottakeren på T-lymfocytter. FluoroBeads ® -T gir brukeren en rask metode til å
separere T-lymfocytt/FluoroBeads ® -T komplekser fra blod med bruken av en innsamlermagnet. FluoroBeads ® -T metoden trenger
ingen kalde inkubasjoner, roteringer eller sentrifugering. FluoroBeads ® -T fremkaller er en reagens spesielt utviklet til å forbedre
ytelsen av FluoroBeads ® -T immunomagnetiske perler.
PRINSIPP
Immunomagnetiske perler er superparamagnetiske partikler med monoklonale antistoffer koplet til overflatene sine. Perlene kan
innsamles ved bruk av et magnetisk felt. Når det magnetiske feltet blir fjernet, beholder perlene ingen gjenværende magnetisme.
De kan bli magnetisert og gjendispergert gjentatte ganger. Spesifisiteten til det koplede monoklonale antistoffet avgjør typen celler
som blir innsamlet.
REAGENSER
A. Identifikasjon
FluoroNeads ® er superparamagnetiske partikler koplet til monoklonale antistoffer og suspendert i PBS med stabilisatorer og
natriumazid som et konverseringsmiddel. Det monoklonale antistoffet er av murin opprinnelse. FluoroBeads-fremkalleren
inneholder ikke-toksiske proprietære ingredienser.
B. Advarsler eller forsiktighetsregler
1. ADVARSEL: Alle blodprodukter bør bli behandlet som mulig smittsomme. Kildemateriale som dette produktet ble
avledet fra, ble funnet å være negativt da det ble testet med gjeldende FDA-påbudte tester. Ingen kjente testmetoder kan gi
forsikring om at produkter avledet fra humant blod ikke vil overføre smittsomme sykdommer.
2. ADVARSEL: Denne reagensen inneholder 0,01 % natriumazid som under syreholdige forhold avgir hydrazonsyre, en
ekstremt toksisk sammensetning. Reagenser som inneholder natriumazid bør bli uttynnet i rennende vann før de blir kastet.
Disse forholdene er anbefalt for å unngå at de blir kastet i avløpsrør hvor det kan utvikles eksplosive forhold.
3. FORSIKTIG: Ikke bruk lithiumheparin eller EDTA som en antikoagulant for blodprøven din.
4. Se sikkerhetsdatabladet for detaljert informasjon.
C. Bruksanvisning
Se BRUKSANVISNING på side 3.
D. Oppbevaringsinstruksjoner
Oppbevar reagenser ved temperaturen angitt på pakken. Bruk før den trykte utløpsdatoen.
E. Rensing eller behandling er nødvendig for bruk
FluoroBeads ® -T: Resuspender før bruk ved å virvle i 10 sekunder.
Fremkaller: Fortynn én del (10X) lageroppløsning til ni deler 1X PBS uten Ca ++ og Mg ++ salter. Oppbevar ved 2 - 5 ºC.
F. Indikasjoner på ustabilitet
FluoroBeads ® -T: Ikke bruk hvis perlene har klumpet seg. Alvorlig klumping av perlene kan indikere forringelse av produktet.
Fremkaller: 10X fremkaller bør være en lett farget, klar oppløsning. Dannelse av bunnfall kan indikere ustabilitet eller
bakteriekontaminering.
FB-TDEV-PI-NO-00, Rev 7 Side 1 av 4

PRØVEINNSAMLING OG FORBEREDELSE
Ta ca. 10 ml helblod. Den foretrukne antikoagulanten er ACD eller CPDA. Ikke bruk lithiumheparin! T-celler bør bli isolert innen
24 timer for å oppnå den høyeste ytelsen. Blod opptil 3 dager gammelt kan imidlertid brukes. Oppbevar blodprøven horisontalt ved
romtemperatur ( 20 - 25 ºC).
PROSEDYRE
A. Materialer som følger med
1. FluoroBeads ® -T
2. Instruksjoner for celleisolasjon og -testing
3. FluoroBeads ® -T fremkaller (10X). Se ”Rensing eller behandling som er nødvendig for bruk” for 1X-instruksjoner.
B. Materialer som er nødvendige, men som ikke følger med
1. Klasse I-vevbestemmelsesbrett (One Lambda eller tilsvarende)
2. 5 ml og 1,5 ml plast- eller glass-sentrifugerør med korker
3. Fosfatbufret saltoppløsning (PBS) uten Ca ++ og Mg ++ salter (f.eks. Irvine Scientific Kat. #9242)
4. McCoys middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS
5. Magnetisk separator (One Lambda eller tilsvarende)
6. Aspirator eller pipetter til engangsbruk
7. Varm uaktivert fetalt kalveserum (HIFCS)
a) Stamoppløsning: Varm FCS ved 56 ºC i 30 minutter for å inaktivere komplement. Oppbevar ved 2 - 5 ºC eller
alikvoter og frys ved -20 ºC.
b) Arbeidsoppløsninger: Tilsett 5 ml HIFCS lageroppløsning til 95 ml med McCoys middek eller tilsvarende.
C. Valgfrie materialer/følger ikke med
1. Ficoll-Hypaque
2. Percoll
a) Stamoppløsning (Percoll-X) Kombiner 1 del med 10X FBS og 9 deler Percoll.
b) Arbeidsoppløsning (50 % Percoll): Bland like deler av Percoll-X og PBS.
3. Stain/Quench-reagenser
a) Akridin oransje/etidiumbrimid FluoroQuench (OLI kat. nr. FQAE500) eller
b) Etidiumbromid FluoroQuench (OLI kat. nr. FQEB500) eller
c) Tilsett 1 ml EB-stamoppløsning til 9 ml hemoglobin eller 1 % blekk (Se Materialer nr. 11 - 14)
4. Hemoglobin: Oppløs 10 g hemoglobin i 90 ml 5 % EDTA/PBS. Bring volum til 99 ml. Tilsett 1 ml med 1 % natriumazid.
Sentrifuger ved 1000 g i 45 minutter. Oppbevar supernatant ved -20 ºC.
5. Blekk: Oppløs 1 g okse serumalbumin (BSA) i 10 ml 5 % EDTA/PBS, tilsett 0,1 m l % natriumazid og 0,1 ml Higgins
svart kalligrafiblekk
6. 1 % natriumazid: Oppløs 1 g natriumazid i 100 ml PBS.
Forsiktig: Natriumazid er toksisk. Bruk alltid verneutstyr når du håndterer natriumazid.
7. 5 % dinatrium etylendiamin-tetrasur syre (EDTA)/PBS: Tilsett 5 g EDTA i 90 ml PBS. Juster pH til 7,2 med 10 M NaOH
for å oppløse EDTA. Bring volum til 100 ml med PBS.
8. Etidiumbromid (stamoppløsning): Oppløs 50 mg i 1 ml destillert vann. Tilsett 49 ml PBS. Varm i vannbad ved 56 ºC i 30
min. Alikvoter og frys ved -20 ºC.
9. Karboksyfluorescein diacetat (CFDA):
a) Stam-CFDAoppløsning: Oppløs 10 mg CFDA i 1 ml aceton et glassrør. Oppbevar ved -20 ºC. Oppbevar i mørke.
b) Arbeidsoppløsninger: Bruk en av de følgende:
Forberedt i PBS ved pH 7,2: Tilsett 30 μl CFDA lageroppløsning til 5 ml PBS (pH 7,2). Oppbevar ved 2 - 5 ºC i
opptil en uke.
Forberedt i PBS ved pH 5,5: Tilsett 30 μl CFDA lageroppløsning til 5 ml PBS (pH 5,5). Oppbevar ved 2 - 5 ºC i
opptil 1 uke.
D. Trinn-for-trinnprosedyre.
Se BRUKSANVISNING på side 3.
BRUKSANVISNING
ISOLASJONSTEKNIKKER
A. Isolasjon fra helblod
1. Dispenser 2 ml blod inn i et 5 ml rør.
2. Resuspender FluoroBeads ® -T grundig før bruk. Virvle i ca. 10 sekunder
3. Tilsett 100 μl FluoroBeads ® -T til blodprøven. Kork umiddelbart røret og snu det opp ned 2 til 3 ganger for å dispergere
magnetisk perler.
4. Roter røret én gang per sekund i 3 minutter ved 20 - 25 ºC for å tillate binding av perler til T-celler. Må ikke overstige 4
minutter. Bruk et ende-over-ende roteringsutstyr eller bland med hånd.
FB-TDEV-PI-NO-00, Rev 7 Side 2 av 4

5. Tilsett 2 ml med 1X fremkaller (se instruksjonene for ”Behandling som er nødvendig til bruk” ovenfor. Kort røret og snu
det opp ned 2 – 3 ganger for å blande. Dette er et høyst viktig trinn!
6. Ta av korken og plasser røret i en magnetisk separator i 3 hele minutter.
7. Fjern og kast supernatant med en pipette til engangsbruk. Fjern røret fra magneten.
8. Resuspender celler (perler) med 1 – 2 ml PBS. Snu forsiktig røret med en rask bevegelse for å dispergere perlene. Sett
røret tilbake i den magnetiske separatoren i 1 minutt. Fjern og kast supernatant. Gjenta to ganger.
9. Fortsett til ”Merking og cellekonsentrasjonsprosedyrer” (nedenfor) eller resuspender celler (perler) i 0,5 ml med McCoys
middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS.
B. Isolasjon fra Ficoll-grensesnitt
1. Sentrifuger sitrert eller heparinisert blod i 10 minutter ved 400 - 900 g.
2. Innsamle Buffy Coat og fortynn med et likt volum med PBS. Bland godt.
3. Legg et lag av maks. 2 ml Buffy Coat/PBS-blanding over 1,5 ml med Ficoll-Hypaque [Tetthet (D) = 1,077] i 5 ml rør og
sentrifuger i 10 minutter ved 1000 g.
4. Innsamle ca. 1 ml av grensesnitt fra hvert rør og overfør til et sentrifugerør. Sentrifuger i 1,5 minutter ved 3000 g eller 10
minutter ved 1000 g.
5. Kast supernatant og resuspender pellet i PBS. Sentrifuger i 5 minutter ved 1000 g (fjern majoriteten av blodplater).
6. Kast supernatant med pipetter til engangsbruk. Resuspender pellet i 1 ml med 20 % HIFCS/PBS.
7. Dispenser 100 μl med FluorBeads ® -T til prøverøret og kork røret.
8. Roter prøven i 3 minutter ved 20 - 25 ºC.
9. Ta av korken og plasser røret i en magnetisk separator i 1 minutt.
10. Fjern og ta vare på supernatant i et annert rør til B-lymfocyttisolasjon med FluoroBeads ® -B.
11. Resuspender perler/celler i 1 ml 20 % HIFCS/PBS. Snu forsiktig røret med en rask bevegelse for å resuspendere perlene.
Plasser i en magnetisk separator i 30 sekunder. Kast supernatant med en pipette til engangsbruk. Gjenta 2 ganger.
12. Fortsett til ”Merking og cellekonsentrasjonsprosedyrer” (nedenfor) eller resuspender celler (perler) i 0,5 ml med McCoys
middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS.
C. Isolasjon fra frossent Ficoll-grensesnitt
1. Tin hele celler ved 56 ºC (DMSO -fjerning er ikke nødvendig).
2. Legg et lag av 0,5 ml cellesuspensjon over 0,5 ml med 50 % Percoll i et 1,5 ml sentrifugerør.
3. Sentrifuger ved 2000 g i 2 minutter eller ved 400 g i 10 minutter
4. Kast supernatant med pipetter til engangsbruk.
5. Resuspender celler i 1 ml 20 % HIFCS/PBS.
6. Dispenser 100 μl med FluoroBeads ® -T til prøverøret og kork røret.
7. Roter prøven i 3 minutter ved 20 - 25 ºC.
8. Ta av korken og plasser røret i en magnetisk separator i 1 minutter.
9. Fjern supernatant til et annet sentrifugerør til B-lymfocyttisolasjon med FluoroBeads ® -B.
10. Resuspender de resterende perler/celler i 1 ml 20 % HIFCS/PBS. Snu forsiktig røret med en rask bevegelse for å
resuspendere perlene og plasser på en magnetisk separator i 30 sekunder. Kast supernatant ved bruk av pipetter til
engangsbruk. Gjenta to ganger.
11. Fortsett til ”Merking og cellekonsentrasjonsprosedyrer” (nedenfor) eller resuspender celler (perler) i 0,5 ml med McCoys
middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS.
MERKING OG CELLEKONSENTRASJONSPROSEDYRER
A. CFDA-metode
1. Ta av korken og plasser røret i en magnetisk separator i 1 minutter. Fjern supernatant. Vask celler (perler) to ganger med
PBS.
2. Tilsett 0,5 ml med CFDA (arbeidsoppløsning, pH 5,5) og bland.
3. Inkuber røret horisontalt i mørke i 10 minutter ved 20 til 25 ºC.
4. Separer magnetisk (som beskrevet ovenfor) og vask celler to ganger med PBS.
5. Resuspender celler i 0,5 ml McCoys middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS
6. Tilsett 1 μl cellesuspensjon til en tom brønn på et Terasaki-brett. Kontroller celletall med et fluorescent mikroskop. Juster
konsentrasjonene til 2 x 10 6 /ml (2.000 celler per brønn).
7. Prøver kan bli overført til 1,5 ml rør og oppbevart horisontalt ved 2 º til 5 ºC opptil 2 dager før testing.
B. FQAE-metode
1. Tilsett 1 μl celler (perler) til en tom brønn på et Terasaki-brett.
2. Tilsett 5 μl FQAE (OLI Kat. nr. FQAE 500) til brønnen..
3. Kontroller celletall med et fluorescent mikroskop. Juster konsentrasjonene til 2 x 10 6 /ml (2.000 celler per brønn).
4. Prøver kan bli overført til 1,5 ml rør og oppbevart horisontalt ved 2 til 5 ºC opptil 2 dager før testing.
FB-TDEV-PI-NO-00, Rev 7 Side 3 av 4

ABC-TYPEBESTEMMELSE
A. CFDA-metode
1. Bland celleforberedelsen ved å banke lett på pellet og å snu røret opp ned. Ikke bland med en sprøyte. Tilsett 1 μl CFDAmerkede
celler (perler) til hver brønn av et HLA klasse II typebestemmelsesbrett.
2. Inkuber i mørke i 30 minutter ved 20 - 25 ºC. (For OLI LMT, inkubere i 60 minutter ved 20 - 25 ºC og fortsett til
trinn nr. 5).
3. Tilsett 5 μl ABC-kaninkomplement til hver brønn.
4. Inkuber brettet horisontalt i mørke i 1 minutter ved 20 til 25 ºC.
5. For hver brønn tilsett 5 μl av én av de følgende ingrediensene.
a) FluoroQuench etidiumbromid (OLI Kat. nr. FQEB500) eller
b) EB/hemoglobin arbeidsoppløsning eller
c) EB/1 % blekk arbeidsoppløsning.
6. Brett kan bli avlest umiddelbart eller kan bli oppbevart i mørke ved 2 til 5 ºC i opptil 2 dager.
B. FQAE-metode
1. Bland celleforberedelsen ved å banke lett på pellet og å snu røret opp ned. Ikke bland med en sprøyte. Tilsett 1 μl celler
(perler) til hver brønn av et HLA klasse I typebestemmelsesbrett.
2. Inkuber i mørke i 30 minutter ved 20 - 25 ºC. (For OLI LMT, inkubere i 60 minutter ved 20 - 25 ºC og fortsett til trinn
nr. 5).
3. Tilsett 5 μl kaninkomplement til hver brønn.
4. Inkuber brettet horisontalt i mørke i 1 time ved 20 - 25 ºC.
5. TiIsett 5 μl med FQAE til hver brønn.
6. Brett kan bli avlest umiddelbart eller kan bli oppbevart i mørke ved 2 - 5 ºC i opptil 2 dager.
PROSEDYRENS BEGRENSNINGER
Celleytelsen vil variere med hver prøve avhengig av celletall og tiden siden blodtakingen. En rekke sykdommer kan forårsake en
reduksjon i lymfocyttytelsen. Noen medikamenter kan også forårsake en reduksjon i lymfocyttytelser, og kan forårsake en
reduksjon i HLA-antigenuttrykk. Prøver fra kadavre kan ha lave lymfocyttytelser med forhøyet monocytt og granulocyttkontaminering.
Kontaminering med andre celler kan forårsake svake/falske negative reaksjoner. Monocytter har en variabel mengde med HLA
klasse I- og klasse II-antigener. Blodplater har HLA klasse I-antigener og kan svekke antisera ved å absorbere antistoffene fra
antisera.
FORVENTEDE VERDIER
FluoroBeads ® -T inneholder nok immunomagnestiske perler til å isolere mer enn 90 % av CD2+T-cellene i 1 ml med helblod.
SPESIELLE PRESTASJONSKJENNETEGN
Renheten til lymfocyttene som ble isolert, bør være over 90 %. Celler bør være reaktive med anti-HLA sera og bør bli lysert under
standard analyseforhold for lymfocytttoksisitet.
EUROPEISK AUTORISERT REPRESENTANT
MDSS GMbH, Schiffgraben 41, D30175, Hannover, Tyskland
REVISJONSHISTORIE
Revisjon Dato Revisjonsbeskrivelse
6 2007/04 Klarifiser hvilke antikoagulanter som ikke er akseptable Oppdater MDSS-adresse.
7 2011/09 Fjernet katalog-ID FB1-40
FB-TDEV-PI-NO-00, Rev 7 Side 4 av 4