fluorobeads b and phosphate buffered saline \(pbs\) - One Lambda

D. Isolasjon fra helblod
1. Overfør 5 ml helblod til et 15 ml rør.
2. Tilsett 5 ml 1X PBS/sitrat og bland ved å snu røret opp ned.
3. Dispenser 100 μl FluoroBeads ® -B inn i prøven og roter én gang per sekund i 5 minutter (ikke roter mer enn 5
minutter) med enten en ende-over-ende rotator eller med hånd ved 20 til 25 ºC.
4. Ta av korken og plasser røret i en magnet i 5 minutter. Fjern og kast supernatant. Fjern røret fra magneten.
5. Tilsett 2 til 3 ml med 1X PBS/sitrat til prøven. Snu forsiktig røret med en rask bevegelse for å resuspendere perlene.
Plasser røret i en magnet i 1 minutt. Gjenta to ganger ved kun å bruke PBS.
6. Fortsett til ”Merking og cellekonsentrasjonsprosedyrer” nedenfor eller resuspender celler (perler) i 0,5 ml med
McCoys middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS.
MERKING OG CELLEKONSENTRASJONSPROSEDYRER
A. CFDA-metode
1. Ta av korken og plasser røret i en magnetisk separator i 1 minutter. Fjern supernatant. Resuspender celler (perler)
med PBS. Gjenta to ganger.
2. Tilsett 0,5 ml med CFDA (arbeidsoppløsning, pH 5,5) og bland.
3. Inkuber røret horisontalt i mørke i 10 minutter ved 20 til 25 ºC.
4. Gjenta trinn 1 ovenfor.
5. Resuspender celler i 0,5 ml McCoys middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS
6. Tilsett 1 μl cellesuspensjon til en tom brønn på et Terasaki-brett. Kontroller celletall med et fluorescent mikroskop.
Juster konsentrasjonene til 2 x 10 6 /ml (2.000 celler per brønn).
7. Prøver kan bli overført til 1,5 ml rør og oppbevart horisontalt ved 2 til 5 ºC opp til 2 dager før testing.
B. FQAE-metode
1. Tilsett 1 μl celler (perler) til en tom brønn på et Terasaki-brett.
2. Tilsett 5 μl FQAE (OLI Kat. nr. FQAE 500) til brønnen..
3. Kontroller celletall med et fluorescent mikroskop. Juster cellekonsentrasjon til 2 x 10 6 /ml (2000 celler per brønn).
4. Prøver kan bli overført til 1,5 ml rør og oppbevart horisontalt ved 2 til 5 ºC opp til 2 dager før testing.
DR-TYPBESTEMMELSESPROSEDYRER
Merk: Følgende er anbefalte protokoller. Inkubasjonstider kan variere avhengig av styrken av typebestemmelsesreagensene
og/eller komplementet som blir brukt. (Tretti minutter med antistoff og seksti minutter med komplement blir anbefalt for One
Lambda-vevtypebestemmelsesreagenser.)
A. CFDA-metode
1. Bland celleforberedelsen ved å banke lett på pellet og å snu røret opp ned. Ikke bland med en sprøyte. Tilsett 1 μl
CFDA-merkede celler (perler) til hver brønn av et HLA klasse II typingsbrett.
2. Inkuber i mørke i 30 minutter ved 20 til 25 ºC. (For monoklonale DR-brett, inkuber i 60 minutter ved 20 til
25 ºC og fortsett til trinn 5 nedenfor.)
3. Tilsett 5 μl kaninkomplement til hver brønn.
4. Inkuber brettet i mørke i 1 minutter ved 20 til 25 ºC.
5. For hver brønn tilsett 5 μl av én av de følgende ingrediensene.
a. FluoroQuench etidiumbromid (OLI Kat. nr. FQEB500) eller
b. EB/hemoglobin arbeidsoppløsning eller
c. EB/1 % blekk arbeidsoppløsning.
6. Brett kan bli avlest umiddelbart eller kan bli oppbevart i mørke ved 20 til 25 ºC i opptil 2 dager.
B. FQAE-metode
1. Bland celleforberedelsen ved å banke lett på pellet og å snu røret opp ned. Ikke bland med en sprøyte. Tilsett 1 μl
celler (perler) til hver brønn av et HLA klasse II typebestemmelsesbrett.
2. Inkuber i 30 minutter ved 20 til 25 ºC. (For monoklonale DR-brett, inkuber i 60 minutter ved 20 til 25 ºC og fortsett
til trinn 5 nedenfor.)
3. Tilsett 5 μl kaninkomplement til hver brønn.
4. Inkuber 1 time i mørke ved 20 til 25 ºC.
5. TiIsett 5 μl med FQAE til hver brønn.
6. Brett kan bli avlest umiddelbart eller kan bli oppbevart i mørke ved 20 til 25 ºC i opptil 2 dager.
FB-BPBS-PI-NO-00, Rev. 10 Side 4 av 5