fluorobeads b and phosphate buffered saline \(pbs\) - One Lambda
fluorobeads b and phosphate buffered saline \(pbs\) - One Lambda
fluorobeads b and phosphate buffered saline \(pbs\) - One Lambda
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
D. Isolasjon fra helblod<br />
1. Overfør 5 ml helblod til et 15 ml rør.<br />
2. Tilsett 5 ml 1X PBS/sitrat og bl<strong>and</strong> ved å snu røret opp ned.<br />
3. Dispenser 100 μl FluoroBeads ® -B inn i prøven og roter én gang per sekund i 5 minutter (ikke roter mer enn 5<br />
minutter) med enten en ende-over-ende rotator eller med hånd ved 20 til 25 ºC.<br />
4. Ta av korken og plasser røret i en magnet i 5 minutter. Fjern og kast supernatant. Fjern røret fra magneten.<br />
5. Tilsett 2 til 3 ml med 1X PBS/sitrat til prøven. Snu forsiktig røret med en rask bevegelse for å resuspendere perlene.<br />
Plasser røret i en magnet i 1 minutt. Gjenta to ganger ved kun å bruke PBS.<br />
6. Fortsett til ”Merking og cellekonsentrasjonsprosedyrer” nedenfor eller resuspender celler (perler) i 0,5 ml med<br />
McCoys middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS.<br />
MERKING OG CELLEKONSENTRASJONSPROSEDYRER<br />
A. CFDA-metode<br />
1. Ta av korken og plasser røret i en magnetisk separator i 1 minutter. Fjern supernatant. Resuspender celler (perler)<br />
med PBS. Gjenta to ganger.<br />
2. Tilsett 0,5 ml med CFDA (arbeidsoppløsning, pH 5,5) og bl<strong>and</strong>.<br />
3. Inkuber røret horisontalt i mørke i 10 minutter ved 20 til 25 ºC.<br />
4. Gjenta trinn 1 ovenfor.<br />
5. Resuspender celler i 0,5 ml McCoys middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS<br />
6. Tilsett 1 μl cellesuspensjon til en tom brønn på et Terasaki-brett. Kontroller celletall med et fluorescent mikroskop.<br />
Juster konsentrasjonene til 2 x 10 6 /ml (2.000 celler per brønn).<br />
7. Prøver kan bli overført til 1,5 ml rør og oppbevart horisontalt ved 2 til 5 ºC opp til 2 dager før testing.<br />
B. FQAE-metode<br />
1. Tilsett 1 μl celler (perler) til en tom brønn på et Terasaki-brett.<br />
2. Tilsett 5 μl FQAE (OLI Kat. nr. FQAE 500) til brønnen..<br />
3. Kontroller celletall med et fluorescent mikroskop. Juster cellekonsentrasjon til 2 x 10 6 /ml (2000 celler per brønn).<br />
4. Prøver kan bli overført til 1,5 ml rør og oppbevart horisontalt ved 2 til 5 ºC opp til 2 dager før testing.<br />
DR-TYPBESTEMMELSESPROSEDYRER<br />
Merk: Følgende er anbefalte protokoller. Inkubasjonstider kan variere avhengig av styrken av typebestemmelsesreagensene<br />
og/eller komplementet som blir brukt. (Tretti minutter med antistoff og seksti minutter med komplement blir anbefalt for <strong>One</strong><br />
<strong>Lambda</strong>-vevtypebestemmelsesreagenser.)<br />
A. CFDA-metode<br />
1. Bl<strong>and</strong> celleforberedelsen ved å banke lett på pellet og å snu røret opp ned. Ikke bl<strong>and</strong> med en sprøyte. Tilsett 1 μl<br />
CFDA-merkede celler (perler) til hver brønn av et HLA klasse II typingsbrett.<br />
2. Inkuber i mørke i 30 minutter ved 20 til 25 ºC. (For monoklonale DR-brett, inkuber i 60 minutter ved 20 til<br />
25 ºC og fortsett til trinn 5 nedenfor.)<br />
3. Tilsett 5 μl kaninkomplement til hver brønn.<br />
4. Inkuber brettet i mørke i 1 minutter ved 20 til 25 ºC.<br />
5. For hver brønn tilsett 5 μl av én av de følgende ingrediensene.<br />
a. FluoroQuench etidiumbromid (OLI Kat. nr. FQEB500) eller<br />
b. EB/hemoglobin arbeidsoppløsning eller<br />
c. EB/1 % blekk arbeidsoppløsning.<br />
6. Brett kan bli avlest umiddelbart eller kan bli oppbevart i mørke ved 20 til 25 ºC i opptil 2 dager.<br />
B. FQAE-metode<br />
1. Bl<strong>and</strong> celleforberedelsen ved å banke lett på pellet og å snu røret opp ned. Ikke bl<strong>and</strong> med en sprøyte. Tilsett 1 μl<br />
celler (perler) til hver brønn av et HLA klasse II typebestemmelsesbrett.<br />
2. Inkuber i 30 minutter ved 20 til 25 ºC. (For monoklonale DR-brett, inkuber i 60 minutter ved 20 til 25 ºC og fortsett<br />
til trinn 5 nedenfor.)<br />
3. Tilsett 5 μl kaninkomplement til hver brønn.<br />
4. Inkuber 1 time i mørke ved 20 til 25 ºC.<br />
5. TiIsett 5 μl med FQAE til hver brønn.<br />
6. Brett kan bli avlest umiddelbart eller kan bli oppbevart i mørke ved 20 til 25 ºC i opptil 2 dager.<br />
FB-BPBS-PI-NO-00, Rev. 10 Side 4 av 5