fluorobeads b and phosphate buffered saline \(pbs\) - One Lambda

21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA 91303-2801 Telf. +1 (818) 702-0042 Faks: (818) 702-6904 www.onelambda.com
PRODUKTVEDLEGG
FLUOROBEADS ® -B AND PHOSPHATE BUFERED SALINE (PBS)/CITRAT REAGENT
[FLUOROBEADS ® -B OG FOSFATBUFRET SALTOPPLØSNING (PBS) SITRATREAGENS]
Katalog FB2-25, FB2-100, PC1-500
Til generell laboratoriebruk.
TILTENKT BRUK
FluoroBeads ® -B gir en enkel prosedyre for isolasjonene av B-lymfocytter til bruk i HLA klasse II typebestemmelsesanalyser
som bruker fluorescente fargestoffer. PBS/sitrat er en reagens til bruk i FluoroBeads ® -B isolasjonsmetoden.
SAMMENDRAG OG FORKLARING
FluoroBead ® -B er immunomagnestisk perler som er mindre enn 1 mikron i diameter. Anti-CD19 monoklonale antistoffer er
koplet til perleoverflaten. CD 19 antistoffer binder spesielt til B-lymfocytter. FluoroBeads ® -B gir brukeren en rask metode til
å separere B-lymfocytter fra blod med bruken av en innsamlermagnet. FluoroBeads ® -B metoden trenger ingen kalde
inkubasjoner, roteringer eller sentrifugeringer. PBS/sitrat forbedrer ytelsen til perlene.
PRINSIPP(ER)
Immunomagnetiske perler er superparamagnetiske partikler med monoklonale antistoffer koplet til overflatene sine. Perlene
kan innsamles ved bruk av et magnetisk felt. Når det magnetiske feltet blir fjernet, beholder perlene ingen gjenværende
magnetisme. De kan bli magnetisert og gjendispergert gjentatte ganger. Spesifisiteten til det koplede monoklonale antistoffet
avgjør typen celler som blir innsamlet.
REAGENSER
A. Identifikasjon
FluoroBeans ® -B er superparamagnetiske partikler koplet til anti-CD19 monoklonalt antistoff og suspendert i BSA/PBS
med NaN3 som et konserveringsmiddel. Det monoklonale antistoffet er av murin opprinnelse. PBS/sitratreagensen
inneholder sitronsyre, Na3-sitrat, PBS og andre proprietære ingredienser.
B. Advarsler eller forsiktighetsregler
1. Til generell laboratoriebruk.
2. ADVARSEL: Alle blodprodukter bør bli behandlet som mulig smittsomme. Kildemateriale som dette produktet ble
avledet fra, ble funnet å være negativt da det ble testet med gjeldende FDA-påbudte tester. Ingen kjente testmetoder
kan gi forsikring om at produkter avledet fra humant blod ikke vil overføre smittsomme sykdommer.
3. ADVARSEL: Denne reagensen inneholder 0,01% natriumazid som under syreholdige forhold avgir hydrazonsyre,
en ekstremt toksisk sammensetning. Reagenser som inneholder natriumazid bør bli uttynnet i rennende vann før de
blir kastet. Disse forholdene er anbefalt for å unngå at de blir kastet i avløpsrør hvor det kan utvikles eksplosive
forhold.
4. FORSIKTIG: Ikke bruk lithiumpeharin som en antikoagulant for blodprøven din.
5. Se sikkerhetsdatabladet for detaljert informasjon.
C. Bruksanvisning
Se BRUKSANVISNING på side 3.
D. Oppbevaringsinstruksjoner
Oppbevar reagenser ved temperaturen angitt på pakken. Bruk før den trykte utløpsdatoen.
E. Rensing eller behandling er nødvendig for bruk
Resuspender FluoroBeads ® -B grundig før bruk ved å virvle i ca. 10 sekunder.
F. Indikasjoner på ustabilitet
Ikke bruk hvis perlene har klumpet seg. Alvorlig klumping av perler kan indikere forringelse av produktet.
PRØVEINNSAMLING OG FORBEREDELSE
Ca. 10 ml av helblod skal tas. Den foretrukne antikoagulanten er ACD eller CPDA. Ikke bruk lithiumheparin! B-celler bør
bli isolert innen 24 timer for å oppnå den høyeste ytelsen. Blod opptil 3 dager gammelt kan imidlertid brukes. Oppbevar
FB-BPBS-PI-NO-00, Rev. 10 Side 1 av 5

lodprøven horisontalt ved romtemperatur (20 til 25 ºC) til du begynner isolasjonsprosessen.
PROSEDYRE
A. Materialer som følger med
1. FluoroBeads ® -B
2. Instruksjoner for celleisolasjon og -testing
1. Materialer som er nødvendige, men som ikke følger med
1. Klasse II typebestemmelsesbrett (One Lambda eller tilsvarende)
2. 5 ml og 1,5 ml plast- eller glass-sentrifugerør med korker
3. Fosfatbufret saltoppløsning (PBS) uten Ca++ og Mg++ salter (f.eks. Irvine Scientific Kat. #9249)
4. McCoys middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS
5. Magnetisk separator (One Lambda eller tilsvarende)
6. Aspirator eller pipetter til engangsbruk
7. PBS/sitratreagens
a. OLI Kat. nr. PCI-500
b. PBS/sitratreagens
1) Stamblanding (10X sitrat): Oppløs 7 g trinatriumsitrat dihydrat og 2,5 g sitronsyre i 90 ml destillert vann.
Bring endelig volum til 100 ml. Filtrer, steriliser og oppbevar ved 2 til 5 º C.
2) Arbeidsoppløsning (1X PBS/sitrat): Tilsett 10 ml med 10X sitrat til 90 ml PBS. Filtrer, steriliser og
oppbevar ved 2 til 5 ºC.
8) Varm uaktivert fetalt kalveserum (HIFCS)
a. Stamoppløsning: Varm FCS ved 56 ºC i 30 minutter for å inaktivere komplementet. Oppbevar med 2 til 5 ºC eller
alikvoter og frys ved -20 ºC.
b. Arbeidsoppløsninger: Tilsett 5 ml HIFCS legeroppløsning til 95 ml med McCoys middel eller tilsvarende.
B. Valgfrie materialer/følger ikke med
1. Ficoll-Hypaque
2. Percoll
a. Stamoppløsning (Percoll-X) Kombiner 1 del med 10X FBS og 9 deler Percoll [Tetthet (D) = 1,077].
b. Arbeidsoppløsning (50 % Percoll): Bland like deler av Percoll-X og PBS.
3. Stain/Quench-reagenser
a. Akridin oransje/etidiumbrimid FluoroQuench (OLI kat. nr. FQAE500) eller
b. Etidiumbrimid FluoroQuench (OLI kat. nr. FQEB500) eller
c. Tilsett 1 ml EB-lageroppløsning til 9 ml hemoglobin eller 1 % blekk (Se Materialer nr. 12-16)
FORSIKTIG: Natriumazid er toksisk. Bruk alltid verneutstyr når du håndterer natriumazid.
4. Hemoglobin: Oppløs 10 g hemoglobin i 90 ml 5 % EDTA/PBS. Bring volum til 99 ml. Tilsett 1 ml med 1 %
natriumazid. Sentrifuger ved 1000 g i 45 minutter. Oppbevar supernatant ved -20 ºC.
5. Blekk: Oppløs 1 g okse serumalbumin (BSA) i 10 ml 5 % EDTA/PBS. Tilsett 0,1 ml 1 % natriumazid og 0,1 ml
Higgins svart kalligrafiblekk.
6. 1 % natriumazid: Oppløs 1 g natriumazid i 100 ml PBS.
7. 5 % dinatrium etylendiamin-tetrasur syre (EDTA)/PBS: Tilsett 5 g ED TA i 90 ml PBS. Juster pH til 7,2 med 10 M
NaOH for å oppløse EDTA. Bring volum til 100 ml med PBS.
8. Etidiumbromid (lageroppløsning): Oppløs 50 mg i 1 ml destillert vann. Tilsett 49 ml PBS. Varm i vannbad ved
56 ºC i 30 minutter. Alikvoter og frys ved -20 ºC.
9. Karboksyfluorescein diacetat (CFDA)
a. Stam-CFDAoppløsning: Oppløs 10 mg CFDA i 1 ml aceton et glassrør. Oppbevar ved -20 ºC. Oppbevar i
mørke.
b. Arbeidsoppløsning. Bruk en av de følgende:
Forberedt i PBS ved pH 7,2: Tilsett 30 μl CFDA lageroppløsning til 5 ml PBS (pH 7,2). Oppbevar ved 2 til
5 ºC i opptil én uke.
2. Forberedt i PBS ved pH 5,5: Tilsett 30 μl CFDA lageroppløsning til 5 ml PBS (pH 5,5). Oppbevar ved 2 til 5 ºC i
opptil én uke.
Trinn-for-trinnprosedyre.
Se BRUKSANVISNING nedenfor.
BRUKSANVISNING
ISOLASJONSTEKNIKKER
FB-BPBS-PI-NO-00, Rev. 10 Side 2 av 5

A. Isolasjon fra Buffy Coat
1. Sentrifuger helblod ved 400 til 900 g i 10 minutter.
2. Overfør ca. 1 ml med Buffy Coat til et 5 ml rør.
3. Tilsett 4 ml PBS/sitrat.
4. Resuspender FluoroBeads ® -B grundig før bruk. Virvle i ca. 10 sekunder.
5. Tilsett 100 μl FluoroBeads ® -B til blodprøven. Kork umiddelbart røret og snu det opp ned 2 til 3 ganger for å
dispergere magnetisk perler.
6. Roter røret én gang per sekund i 3 minutter ved 20 til 25 ºC for å la perlene binde til B-celler. Må ikke overstige 4
minutter. Bruk et ende-over-ende roteringsutstyr eller bland med hånd.
7. Ta av korken og plasser røret i en magnetisk separator i 2 minutter. Må ikke overstige 3 minutter.
8. Fjern og kast supernatant med en pipette til engangsbruk. Fjern røret fra magneten.
9. Resuspender celler (perler) med 1 til 2 ml PBS/sitrat. Snu forsiktig røret med en rask bevegelse for å dispergere
perlene. Sett røret tilbake i den magnetiske separatoren i 1 minutt. Fjern og kast supernatant. Gjenta to ganger ved
kun å bruke PBS.
10. Fortsett til ”Merking og cellekonsentrasjonsprosedyrer” (nedenfor) eller gjensuspender celler (perler) i 0,5 ml med
McCoys middel eller tilsvarende middel med 5 % HIFCS.
B. Isolasjon fra Ficoll-grensesnitt
1. Sentrifuger sitrert eller heparinisert blod i 10 minutter ved 400 til 900 g.
2. Innsamle Buffy Coat og fortynn med et likt volum med PBS. Bland godt.
3. Legg et maks. 2 ml Buffy Coat/PBS-blanding over 1,5 ml med Ficoll-Hypaque [Tetthet (D) = 1,077] i 5 ml rør og
sentrifuger i 10 minutter ved 1000 g.
4. Innsamle ca. 1 ml av grensesnitt fra hvert rør og overfør til sentrifugerør. Sentrifuger i 1,5 minutter ved 3000 g eller
10 minutter ved 1000 g.
5. Kast supernatant og resuspender pellet i PBS. Sentrifuger i 5 minutter ved 1000 g (fjern majoriteten av blodplater).
6. Kast supernatant med pipetter til engangsbruk. Resuspender pellet i 1 ml med 20 % HIFCS/PBS.
7. Dispenser 100 μl FluorBeads ® -B til prøverøret og kork røret.
8. Roter prøven én gang per sekund i 3 minutter ved 20 til 25 ºC.
9. Ta av korken og plasser røret i en magnetisk separator i 1 minutter.
10. Fjern og ta vare på supernatant i et annert rør til T-lymfocyttisolasjon med FluoroBeads ® -T.
11. Resuspender perler/celler i 1 ml 20 % HIFCS/PBS. Snu forsiktig røret med en rask bevegelse for å resuspendere
perlene. Plasser i en magnetisk separator i 30 sekunder. Kast supernatant med en pipette til engangsbruk. Gjenta to
ganger.
12. Fortsett til ”Merking og cellekonsentrasjonsprosedyrer” nedenfor eller resuspender celler (perler) i 0,5 ml med
McCoys middel eller tilsvarende middel med 5 % HIFCS.
C. Isolasjon fra frossent Ficoll-grensesnitt
1. Tin hele celler ved 56 ºC (DMSO -fjerning er ikke nødvendig).
2. Legg et lag av 0,5 ml cellesuspensjon over 0,5 50 % Percoll i et 1,5 ml sentrifugerør.
3. Sentrifuger ved 2000 g i 2 minutter eller ved 400 g i 10 minutter
4. Kast supernatant med pipetter til engangsbruk.
5. Resuspender celler i 1 ml 20 % HIFCS/PBS.
6. Dispenser 100 μl FluorBeads ® -B til prøverøret og kork røret.
7. Roter prøven én gang per sekund i 3 minutter ved 20 til 25 ºC.
8. Ta av korken og plasser røret i en magnetisk separator i 1 minutter.
9. Fjern og ta vare på supernatant i et annet rør til T-lymfocyttisolasjon med FluoroBeads ® -T.
10. Resuspender de resterende perler/celler i 1 ml 20 % HIFCS/PBS. Snu forsiktig røret med en rask bevegelse for å
resuspendere perlene og plasser på en magnetisk separator i 30 sekunder. Kast supernatant ved bruk av pipetter til
engangsbruk. Gjenta to ganger.
11. Fortsett til ”Merking og cellekonsentrasjonsprosedyrer” nedenfor eller resuspender celler (perler) i 0,5 ml med
McCoys middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS.
FB-BPBS-PI-NO-00, Rev. 10 Side 3 av 5

D. Isolasjon fra helblod
1. Overfør 5 ml helblod til et 15 ml rør.
2. Tilsett 5 ml 1X PBS/sitrat og bland ved å snu røret opp ned.
3. Dispenser 100 μl FluoroBeads ® -B inn i prøven og roter én gang per sekund i 5 minutter (ikke roter mer enn 5
minutter) med enten en ende-over-ende rotator eller med hånd ved 20 til 25 ºC.
4. Ta av korken og plasser røret i en magnet i 5 minutter. Fjern og kast supernatant. Fjern røret fra magneten.
5. Tilsett 2 til 3 ml med 1X PBS/sitrat til prøven. Snu forsiktig røret med en rask bevegelse for å resuspendere perlene.
Plasser røret i en magnet i 1 minutt. Gjenta to ganger ved kun å bruke PBS.
6. Fortsett til ”Merking og cellekonsentrasjonsprosedyrer” nedenfor eller resuspender celler (perler) i 0,5 ml med
McCoys middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS.
MERKING OG CELLEKONSENTRASJONSPROSEDYRER
A. CFDA-metode
1. Ta av korken og plasser røret i en magnetisk separator i 1 minutter. Fjern supernatant. Resuspender celler (perler)
med PBS. Gjenta to ganger.
2. Tilsett 0,5 ml med CFDA (arbeidsoppløsning, pH 5,5) og bland.
3. Inkuber røret horisontalt i mørke i 10 minutter ved 20 til 25 ºC.
4. Gjenta trinn 1 ovenfor.
5. Resuspender celler i 0,5 ml McCoys middel eller tilsvarende med 5 % HIFCS
6. Tilsett 1 μl cellesuspensjon til en tom brønn på et Terasaki-brett. Kontroller celletall med et fluorescent mikroskop.
Juster konsentrasjonene til 2 x 10 6 /ml (2.000 celler per brønn).
7. Prøver kan bli overført til 1,5 ml rør og oppbevart horisontalt ved 2 til 5 ºC opp til 2 dager før testing.
B. FQAE-metode
1. Tilsett 1 μl celler (perler) til en tom brønn på et Terasaki-brett.
2. Tilsett 5 μl FQAE (OLI Kat. nr. FQAE 500) til brønnen..
3. Kontroller celletall med et fluorescent mikroskop. Juster cellekonsentrasjon til 2 x 10 6 /ml (2000 celler per brønn).
4. Prøver kan bli overført til 1,5 ml rør og oppbevart horisontalt ved 2 til 5 ºC opp til 2 dager før testing.
DR-TYPBESTEMMELSESPROSEDYRER
Merk: Følgende er anbefalte protokoller. Inkubasjonstider kan variere avhengig av styrken av typebestemmelsesreagensene
og/eller komplementet som blir brukt. (Tretti minutter med antistoff og seksti minutter med komplement blir anbefalt for One
Lambda-vevtypebestemmelsesreagenser.)
A. CFDA-metode
1. Bland celleforberedelsen ved å banke lett på pellet og å snu røret opp ned. Ikke bland med en sprøyte. Tilsett 1 μl
CFDA-merkede celler (perler) til hver brønn av et HLA klasse II typingsbrett.
2. Inkuber i mørke i 30 minutter ved 20 til 25 ºC. (For monoklonale DR-brett, inkuber i 60 minutter ved 20 til
25 ºC og fortsett til trinn 5 nedenfor.)
3. Tilsett 5 μl kaninkomplement til hver brønn.
4. Inkuber brettet i mørke i 1 minutter ved 20 til 25 ºC.
5. For hver brønn tilsett 5 μl av én av de følgende ingrediensene.
a. FluoroQuench etidiumbromid (OLI Kat. nr. FQEB500) eller
b. EB/hemoglobin arbeidsoppløsning eller
c. EB/1 % blekk arbeidsoppløsning.
6. Brett kan bli avlest umiddelbart eller kan bli oppbevart i mørke ved 20 til 25 ºC i opptil 2 dager.
B. FQAE-metode
1. Bland celleforberedelsen ved å banke lett på pellet og å snu røret opp ned. Ikke bland med en sprøyte. Tilsett 1 μl
celler (perler) til hver brønn av et HLA klasse II typebestemmelsesbrett.
2. Inkuber i 30 minutter ved 20 til 25 ºC. (For monoklonale DR-brett, inkuber i 60 minutter ved 20 til 25 ºC og fortsett
til trinn 5 nedenfor.)
3. Tilsett 5 μl kaninkomplement til hver brønn.
4. Inkuber 1 time i mørke ved 20 til 25 ºC.
5. TiIsett 5 μl med FQAE til hver brønn.
6. Brett kan bli avlest umiddelbart eller kan bli oppbevart i mørke ved 20 til 25 ºC i opptil 2 dager.
FB-BPBS-PI-NO-00, Rev. 10 Side 4 av 5

PROSEDYRENS BEGRENSNINGER
Celleytelsen vil variere med hver prøve avhengig av celletall og tiden siden blodtakingen. En rekke sykdommer kan
forårsake en reduksjon i lymfocyttytelsen. Noen medikamenter kan også forårsake en reduksjon i lymfocyttytelser, og kan
forårsake en reduksjon i HLAS-antigenuttrykk. Prøver fra kadavre kan ha lave lymfocyttytelser med forhøyet monocytt og
granulocytt-kontaminering.
Kontaminering med andre celler kan forårsake svake/falske negative reaksjoner. Monocytter har en variabel mengde med
HLA klasse I- og klasse II-antigener. Blodplater har HLA klasse I-antigener og kan svekke antisera ved å absorbere
antistoffene fra antisera.
FORVENTEDE VERDIER
PluoroBeads ® -B inneholder nok immunomagnestiske perler til å isolere mer enn 90 % av CD19 + B-cellene i en Buffy Coat
fra 10 ml med helblod.
SPESIELLE PRESTASJONSKJENNETEGN
Renheten til lymfocyttene som ble isolert, bør være over 90 %. Celler bør være reaktive med anti-HLA sera og bør bli lysert
under standard analyseforhold for lymfocytttoksisitet.
EUROPEISK AUTORISERT REPRESENTANT
MDSS GmbH, Schiffgraben 41, D-30175, Hannover, Tyskland
REVISJONSHISTORIE
Revisjon Dato Revisjonsbeskrivelse
9 2011/04 Reviderte katalogliste (endret katalog-ID nummer fra FB-25 til FB2-25). NCR nr, 1454.
10 2011/09 Fjernet katalog-ID FB2-40
FB-BPBS-PI-NO-00, Rev. 10 Side 5 av 5