Inleiding in de capillaire elektroforese: basisbegrippen ... - NVKC
Inleiding in de capillaire elektroforese: basisbegrippen ... - NVKC
Inleiding in de capillaire elektroforese: basisbegrippen ... - NVKC
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
6. Whetham WCD. Phil Trans Roy Soc London, Ser. A<br />
1895; 186: 507.<br />
7. Kohlrausch F., Ann Phys (Leipzig) 1897; 62: 209.<br />
8. Hardy WB. J Physiol 1899; 24: 288.<br />
9. Hardy WB. J Physiol 1905; 33: 251.<br />
10. Michaelis L. Biochem Z 1909; 16: 81.<br />
11. Kendall J and Critten<strong>de</strong>n ED. Proc Nat Acad Sci, US,<br />
1923; 9: 75.<br />
12. Kendall J. Science 1928; 87: 163.<br />
13. L<strong>in</strong><strong>de</strong>mann A. Proc Roy Soc, Ser. A 1921; 99: 102.<br />
14. MacInnes DA and Longsworth LG. Chem Rev 1932; 11:<br />
171.<br />
15. Mart<strong>in</strong> AJP. Mon<strong>de</strong>l<strong>in</strong>ge me<strong>de</strong><strong>de</strong>l<strong>in</strong>g<br />
16. Longsworth LG. Nat Bur Stand (US) Circ No. 524, 1953;<br />
59.<br />
17. Poulik MD. Nature 1957; 180: 1477.<br />
18. Kaimakov EA and Fiks VB. Russ J Phys Chem 1961; 35:<br />
873.<br />
19. Kaimakov EA. Russ J Phys Chem 1961; 36: 436.<br />
20. Konstant<strong>in</strong>ov BP and Kaimakov EA. Russ J Phys Chem<br />
1962; 32: 437.<br />
21. Konstant<strong>in</strong>ovBP, Kaimakov EA and Varshovkaya NL.<br />
Russ J Phys Chem 1962; 36: 535.<br />
22. Konstant<strong>in</strong>ov BP, Kaimakov EA and Varshovkaya NL.<br />
Russ J Phys Chem 1962; 36: 540.<br />
23. Hartley GS. Trans Faraday Soc 1934; 30: 648.<br />
24. Gordon AR and Kay RL. J Chem Phys 1953; 21: 131.<br />
25. Konstant<strong>in</strong>ov BP and Oshurkova OV. Dokl Akad Nauk<br />
SSSR 1963; 148: 1110.<br />
26. Konstant<strong>in</strong>ov BP and Oshurkova OV. Sov Phys Tech Phys<br />
1966; 11: 693.<br />
27. Everaerts FM, Graduation Report, University of Technology,<br />
E<strong>in</strong>dhoven 1964., verkrijgbaar bij <strong>de</strong> auteur.<br />
28. Kaimakov EA and Sharkov VT. Russ J Phys Chem 1964;<br />
38: 893.<br />
29. Ornste<strong>in</strong> L. Ann NY Acad Sci 1964; 121: 321.<br />
30. Davis BJ. Ann NY Acad Sci 1964; 121: 404.<br />
Ned Tijdschr Kl<strong>in</strong> Chem 2000; 25: 210-219<br />
In <strong>de</strong> verschillen<strong>de</strong> bijdragen aan dit themanummer<br />
Capillaire Elektroforese (CE) wor<strong>de</strong>n diverse toepass<strong>in</strong>gen<br />
van <strong>de</strong> CE <strong>in</strong> <strong>de</strong> kl<strong>in</strong>ische chemie beschreven.<br />
Alhoewel “elektroferogrammen” vaak sterk lijken op<br />
“chromatogrammen” is het scheid<strong>in</strong>gspr<strong>in</strong>cipe <strong>elektroforese</strong><br />
dui<strong>de</strong>lijk verschillend van het chromatografisch<br />
scheid<strong>in</strong>gspr<strong>in</strong>cipe. Tene<strong>in</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> verschillen<strong>de</strong><br />
toepass<strong>in</strong>gen van CE te kunnen doorzien wordt <strong>in</strong> dit<br />
<strong>in</strong>lei<strong>de</strong>nd artikel uitgelegd wat <strong>elektroforese</strong> is, wordt<br />
31. Vestermark A. Cons Electrophoresis: An Experimental<br />
Study 1966 (unpublished)<br />
32. Preetz W. Talanta 1966; 13: 1649.<br />
33. Preetz W and Pfeifer HL. Talanta 1967; 14: 255.<br />
34. Preetz W and Pfeifer HL. Anal Chim Acta 1967; 38: 255.<br />
35. Everaerts FM. Thesis, University of Technology, E<strong>in</strong>dhoven,<br />
1968.<br />
36. Mart<strong>in</strong> AJP and Everaerts FM. Anal Chim Acta 1967; 38:<br />
233.<br />
37. Haglund H. Sci Tools 1970; 17: 2.<br />
38. Arl<strong>in</strong>ger L and Routs RJ. Sci Tools 1970; 17: 21.<br />
39. Verheggen Th, Ballegooyen E van, Massen C and Everaerts<br />
FM. J Chromatog 1972; 64: 185.<br />
40. Mikkers FEP, Everaerts FM and Verheggen Th. J Chromatogr<br />
1979; 169: 11.<br />
41. Keulemans AIM, Everaerts FM. Sci Tools 1970; 17: 25.<br />
42. Jorgenson JW and Lukacs KD. Cl<strong>in</strong> Chem 1981; 27:<br />
1551.<br />
43. Terabe S, Otsuka K, Itchikawa K et all. Anal Chem 1984;<br />
56: 111.<br />
44. Hjertén S. Chromatogr Rev 1967; 9: 122.<br />
45. Tiselius A. Trans Faraday Soc 1937; 33: 524.<br />
Aanbevolen boeken:<br />
Everaerts FM, Beckers JL and Verheggen ThPEM. “Isotachophoresis,<br />
Theory, Instrumentation and Applications”. Journal<br />
of Chromatography Library. Elsevier, Amsterdam 1976; 6.<br />
Deyl Z, Everaerts FM, Prusik Z and Svendsen PJ. “Electrophoresis:<br />
a survey of techniques and applications”. Journal of<br />
Chromatography Library. Elsevier, Amsterdam 1979; 18A.<br />
Deyl Z, Chrambach A, Everaerts FM and Prusik Z. “Electrophoresis:<br />
a survey of techniques and applications”. Journal of<br />
Chromatography Library. Elsevier, Amsterdam 1983; 18B.<br />
Li SFY. “Capillairy Electrophoresis-Pr<strong>in</strong>ciples, practice and<br />
applications” Journal of Chromatography Library. Elsevier,<br />
Amsterdam 1992; 52.<br />
<strong>Inleid<strong>in</strong>g</strong> <strong>in</strong> <strong>de</strong> <strong>capillaire</strong> <strong>elektroforese</strong>: <strong>basisbegrippen</strong>, uitvoer<strong>in</strong>gsvormen<br />
en karakteristieken<br />
Faculteit <strong>de</strong>r Scheikundige Technologie (SPO), Technische<br />
Universiteit E<strong>in</strong>dhoven 1 en Kl<strong>in</strong>isch Chemisch Laboratorium,<br />
Ziekenhuis Eemland, Amersfoort 2<br />
Correspon<strong>de</strong>ntie: Dr. Ir. J.L. Beckers, Faculteit <strong>de</strong>r Scheikundige<br />
Technologie (SPO), Technische Universiteit E<strong>in</strong>dhoven,<br />
Postbus 513, 5600 MB E<strong>in</strong>dhoven.<br />
J.L. BECKERS 1 en J.P.M. WIELDERS 2<br />
<strong>de</strong> opbouw van een CE-apparaat beschreven en wordt<br />
een aantal <strong>basisbegrippen</strong> uit <strong>de</strong> <strong>elektroforese</strong> behan<strong>de</strong>ld.<br />
Ook komen <strong>de</strong> verschillen<strong>de</strong> uitvoer<strong>in</strong>gsvormen<br />
en enige typische kenmerken van <strong>elektroforese</strong> aan <strong>de</strong><br />
or<strong>de</strong>.<br />
Wat is <strong>elektroforese</strong>?<br />
Al <strong>in</strong> 1808 beschrijft von Reuss (1) een experiment,<br />
waarbij hij een potentiaalverschil aanlegt over twee<br />
elektro<strong>de</strong>n, die zich bev<strong>in</strong><strong>de</strong>n <strong>in</strong> twee glazen buisjes,<br />
gestoken <strong>in</strong> een brok vochtige klei. Hij neemt waar<br />
dat <strong>in</strong> één buisje het waterniveau stijgt ten gevolge<br />
van wat later elektro-endosmose wordt genoemd, terwijl<br />
<strong>in</strong> het an<strong>de</strong>re buisje een vertroebel<strong>in</strong>g optreedt<br />
door opstijgen van klei<strong>de</strong>eltjes on<strong>de</strong>r <strong>in</strong>vloed van het<br />
aangeleg<strong>de</strong> elektrische veld. Von Reuss blijkt <strong>in</strong> dit<br />
experiment twee belangrijke verschijnselen waarge-<br />
210 Ned Tijdschr Kl<strong>in</strong> Chem 2000, vol. 25, no. 4
nomen te hebben die van groot belang zijn bij elektroforetische<br />
technieken.<br />
De eerste waarnem<strong>in</strong>g betreft het feit dat vloeistoffen<br />
kunnen bewegen door een poreus materiaal, on<strong>de</strong>r<br />
<strong>in</strong>vloed van een elektrisch veld. Dit verschijnsel word<br />
elektro-endosmose of elektro-osmose genoemd.<br />
Het verschijnsel dat gela<strong>de</strong>n <strong>de</strong>eltjes bewegen <strong>in</strong> een<br />
vloeistof on<strong>de</strong>r <strong>in</strong>vloed van een elektrisch veld wordt<br />
<strong>elektroforese</strong> genoemd. Hierbij krijgen alle <strong>de</strong>eltjes<br />
een kenmerken<strong>de</strong> soort-eigen snelheid, waardoor het<br />
mogelijk is <strong>de</strong> verschillen<strong>de</strong> <strong>de</strong>eltjes naar soort te<br />
schei<strong>de</strong>n. In <strong>de</strong> analytische praktijk wordt dan ook<br />
on<strong>de</strong>r <strong>elektroforese</strong> verstaan het scheid<strong>in</strong>gspr<strong>in</strong>cipe<br />
dat gela<strong>de</strong>n <strong>de</strong>eltjes kunnen wor<strong>de</strong>n geschei<strong>de</strong>n doordat<br />
ze met verschillen<strong>de</strong> snelhe<strong>de</strong>n bewegen on<strong>de</strong>r<br />
<strong>in</strong>vloed van een aangelegd elektrisch veld. Vaak ver<strong>de</strong>elt<br />
men <strong>de</strong> elektroforetische technieken <strong>in</strong> vier<br />
hoofdtypen, waaruit <strong>de</strong>sgewenst hybri<strong>de</strong>n zijn te<br />
vormen:<br />
- <strong>de</strong> “Mov<strong>in</strong>g Boundary” Elektroforese (MBE)<br />
- Isotachoforese (ITP)<br />
- Zone Elektroforese (ZE)<br />
- Isoelectricfocus<strong>in</strong>g (IEF)<br />
In dit <strong>in</strong>lei<strong>de</strong>nd artikel wor<strong>de</strong>n Isotachoforese, Capillaire<br />
Zone Elektroforese (CZE) en Isoelectricfocus<strong>in</strong>g<br />
<strong>in</strong> het kort beschreven. Ook wordt nog <strong>de</strong><br />
Micellaire Elektrok<strong>in</strong>etische Capillaire Chromatografie<br />
(MECC) beschreven, die gebruikt kan wor<strong>de</strong>n<br />
voor <strong>de</strong> scheid<strong>in</strong>g van neutrale componenten en <strong>de</strong><br />
bepal<strong>in</strong>g van <strong>in</strong> water slecht-oplosbare componenten.<br />
Voor uitvoerige beschrijv<strong>in</strong>gen van <strong>de</strong> diverse technieken<br />
zij verwezen naar <strong>de</strong> literatuur (2-10). On<strong>de</strong>r<br />
gebruikmak<strong>in</strong>g van <strong>de</strong> verschillen<strong>de</strong> elektroforetische<br />
technieken kunnen diverse stoffen, die een rol spelen<br />
<strong>in</strong> <strong>de</strong> kl<strong>in</strong>isch-chemische praktijk bepaald wor<strong>de</strong>n,<br />
zowel grote macromoleculen zoals eiwitten, Hb en<br />
DNA, als kle<strong>in</strong>e anionen en kationen.<br />
Apparatuur<br />
De CZE wordt veel toegepast <strong>in</strong> <strong>de</strong> kl<strong>in</strong>ische chemie<br />
voor o.a. <strong>de</strong> eiwitscheid<strong>in</strong>g als screen<strong>in</strong>g op paraproteïnen.<br />
De apparatuur die daarvoor gebruikt wordt bestaat<br />
uit een basisconfiguratie zoals die on<strong>de</strong>r an<strong>de</strong>re<br />
Figuur 1. (a) Schematische voorstell<strong>in</strong>g van <strong>de</strong> opbouw van<br />
<strong>elektroforese</strong> apparatuur. Voor ver<strong>de</strong>re toelicht<strong>in</strong>g zie tekst.<br />
HSA: hoogspann<strong>in</strong>gsapparaat.<br />
Ned Tijdschr Kl<strong>in</strong> Chem 2000, vol. 25, no. 4<br />
geleverd wordt door Beckman Coulter, BioRad en<br />
Perk<strong>in</strong> Elmer. Dergelijke CE-apparatuur bestaat <strong>in</strong><br />
pr<strong>in</strong>cipe uit twee elektro<strong>de</strong>ruimten (“buffervaatjes”),<br />
die met elkaar verbon<strong>de</strong>n wor<strong>de</strong>n door het scheid<strong>in</strong>gscapillair,<br />
dat gevuld is met een buffer. Over het<br />
capillair dat gemaakt is van buigzaam fused silica<br />
wordt een hoogspann<strong>in</strong>g gezet <strong>in</strong> <strong>de</strong> or<strong>de</strong> van 10-30<br />
kVolt, waardoor gela<strong>de</strong>n <strong>de</strong>eltjes gaan bewegen en<br />
geschei<strong>de</strong>n kunnen wor<strong>de</strong>n. Een UV- of fluorescentie<strong>de</strong>tector<br />
meet dwars door het capillair, dat een <strong>in</strong>wendige<br />
diameter heeft van ongeveer 25-100 micrometer.<br />
De data wor<strong>de</strong>n verwerkt door een computer. In fig. 1<br />
(a) is <strong>de</strong> opbouw van zo’n <strong>elektroforese</strong> apparaat<br />
schematisch weergegeven voor <strong>de</strong> P/ACE 5500. Dit<br />
CE-apparaat bestaat uit een tweetal concentrisch geplaatste<br />
draaitafels, zie fig. 1-bovenaanzicht. Hier<strong>in</strong><br />
bev<strong>in</strong><strong>de</strong>n zich glazen flesjes, die <strong>de</strong> benodig<strong>de</strong> elektrolyten<br />
(on<strong>de</strong>r an<strong>de</strong>re buffers en water) bevatten en<br />
<strong>de</strong> monsters. De flesjes zijn voorzien van perforeerbare<br />
dopjes, waar<strong>in</strong> <strong>de</strong> naast elkaar gemonteer<strong>de</strong><br />
elektro<strong>de</strong>n- en capillairuite<strong>in</strong><strong>de</strong>n gepositioneerd wor<strong>de</strong>n,<br />
zie fig. 1, zijaanzicht. Het capillair waar<strong>in</strong> <strong>de</strong><br />
scheid<strong>in</strong>g plaatsv<strong>in</strong>dt, zit <strong>in</strong> een hou<strong>de</strong>r (cartridge),<br />
waar het wordt gekoeld door een vloeistof tene<strong>in</strong><strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> temperatuur constant te hou<strong>de</strong>n, ondanks <strong>de</strong> ontwikkel<strong>de</strong><br />
warmte van het elektroforetische proces. De<br />
lengte van het capillair varieert, afhankelijk van <strong>de</strong><br />
beoog<strong>de</strong> scheid<strong>in</strong>g en ligt tussen <strong>de</strong> 30-100 cm. N.B.<br />
<strong>in</strong> fig. 1 (a) bev<strong>in</strong>dt zich <strong>de</strong> negatieve elektro<strong>de</strong> aan<br />
<strong>de</strong> <strong>de</strong>tectorzij<strong>de</strong>. Dit betekent dat <strong>de</strong> positieve ionen<br />
bewegen richt<strong>in</strong>g <strong>de</strong>tector. Dat er <strong>in</strong> <strong>de</strong>ze opstell<strong>in</strong>g<br />
toch nog negatieve ionen, zoals <strong>de</strong> serumproteïnen,<br />
wor<strong>de</strong>n ge<strong>de</strong>tecteerd komt omdat <strong>de</strong>ze wor<strong>de</strong>n meegesleurd<br />
door elektro-endosmose. De elektro-endosmose<br />
beweegt <strong>in</strong> silica <strong>capillaire</strong>n namelijk <strong>in</strong> <strong>de</strong><br />
richt<strong>in</strong>g van <strong>de</strong> negatieve elektro<strong>de</strong> (zie ver<strong>de</strong>r <strong>de</strong> paragraaf<br />
Mobiliteiten en migratietij<strong>de</strong>n).<br />
Injectie<br />
Het capillair kan gevuld wor<strong>de</strong>n met <strong>de</strong> buffer door<br />
een (gas)druk uit te oefenen op <strong>de</strong> <strong>in</strong> een vaatje aanwezige<br />
bufferoploss<strong>in</strong>g. De draaitafel draait vervolgens<br />
naar een an<strong>de</strong>re positie waar het monster staat<br />
en <strong>in</strong>jecteert vanuit dit an<strong>de</strong>re vaatje het monster.<br />
Deze <strong>in</strong>jectie gebeurt met een veel lagere druk. Een<br />
alternatieve manier is elektrok<strong>in</strong>etisch. Hierbij wordt<br />
het monstervaatje we<strong>de</strong>rom aan het uite<strong>in</strong><strong>de</strong> van het<br />
capillair geplaatst, nadat het scheid<strong>in</strong>gscapillair gevuld<br />
is met <strong>de</strong> buffers en door het aanleggen van een<br />
potentiaalverschil over het capillair wordt een hoeveelheid<br />
monster geïnjecteerd op basis van een ionenstroom.<br />
Bij bei<strong>de</strong> soorten <strong>in</strong>jecties wor<strong>de</strong>n nanoliters<br />
aan monsteroploss<strong>in</strong>g <strong>in</strong>gebracht. Het gebruik van<br />
kle<strong>in</strong>e volum<strong>in</strong>a monsters is één van <strong>de</strong> vele voor<strong>de</strong>len<br />
van CE.<br />
Detectie en registratie<br />
Bij UV-<strong>de</strong>tectie bestaat het <strong>de</strong>tectorsysteem uit een<br />
<strong>de</strong>uteriumlamp met filter, waarvan een bun<strong>de</strong>l UVlicht<br />
met <strong>de</strong> gewenste golflengte naar het capillair<br />
wordt geleid, waarna het doorgelaten UV-licht met<br />
een foto-elektrische cel gemeten wordt en ver<strong>de</strong>r verwerkt<br />
wordt door dataverwerk<strong>in</strong>g. De hoogte van het<br />
211
signaal is volgens <strong>de</strong> wet van Lambert-Beer evenredig<br />
aan <strong>de</strong> concentratie van <strong>de</strong> gemeten component;<br />
dit <strong>de</strong>tectorpr<strong>in</strong>cipe is analoog aan dat bij <strong>de</strong> chromatografie.<br />
Wel dient men hierbij te be<strong>de</strong>nken dat bij<br />
chromatografische processen <strong>in</strong> het algemeen alle<br />
monstercomponenten met eenzelf<strong>de</strong> snelheid <strong>de</strong> <strong>de</strong>tector<br />
passeren, terwijl bij CZE alle componenten<br />
met hun eigen verschillen<strong>de</strong> snelheid <strong>de</strong> <strong>de</strong>tector passeren.<br />
Dit heeft consequenties voor <strong>de</strong> keuze van signaalverwerk<strong>in</strong>g;<br />
<strong>in</strong> het algemeen dient men te werken<br />
met piekoppervlakken en niet met piekhoogten, terwijl<br />
bovendien gecorrigeerd dient te wor<strong>de</strong>n voor<br />
fluctuaties <strong>in</strong> migratietij<strong>de</strong>n. Het bij CZE geregistreer<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>tectorsignaal uitgezet tegen <strong>de</strong> tijd wordt<br />
elektroferogram genoemd. Afwijkend ten opzichte<br />
van chromatografische analysemetho<strong>de</strong>n wordt bij<br />
CZE gesproken van migratietij<strong>de</strong>n en niet van retentietij<strong>de</strong>n.<br />
Het scheid<strong>in</strong>gsproces bij zone <strong>elektroforese</strong><br />
De scheid<strong>in</strong>g van componenten komt tot stand on<strong>de</strong>r<br />
<strong>in</strong>vloed van <strong>de</strong> lad<strong>in</strong>g van <strong>de</strong> componenten, <strong>de</strong><br />
grootte, <strong>de</strong> viscositeit van <strong>de</strong> buffer, <strong>de</strong> spann<strong>in</strong>g over<br />
het silica capillair en <strong>de</strong> vloeistofbeweg<strong>in</strong>g <strong>in</strong> het capillair.<br />
Bij een CZE-scheid<strong>in</strong>g wordt het gehele<br />
scheid<strong>in</strong>gssysteem, <strong>in</strong>clusief elektro<strong>de</strong>ruimten, gevuld<br />
met een zogenaamd backgroun<strong>de</strong>lektrolyt of<br />
BGE. De pH van het elektrolytsysteem en <strong>de</strong> viscositeit<br />
van <strong>de</strong> vloeistof (temperatuurafhankelijk) bepalen<br />
samen met <strong>de</strong> pK-waar<strong>de</strong>n <strong>de</strong> mobiliteit <strong>in</strong> een elektrisch<br />
veld. Om enige typische kenmerken van het<br />
scheid<strong>in</strong>gsproces <strong>in</strong> CZE te <strong>de</strong>monstreren zijn <strong>in</strong> fig.<br />
2 <strong>de</strong> elektroferogrammen voor <strong>de</strong> scheid<strong>in</strong>g van een<br />
mengsel van creat<strong>in</strong><strong>in</strong>e, caffeïne en benzoëzuur weergegeven<br />
on<strong>de</strong>r gebruikmak<strong>in</strong>g van een BGE op pH’s<br />
van 3,5 en 5 respectievelijk. In dit artikel gepresenteer<strong>de</strong><br />
elektroferogrammen zijn gemeten met een<br />
P/ACE 5500 van <strong>de</strong> firma Beckman Coulter, waarvan<br />
<strong>de</strong> <strong>in</strong>stell<strong>in</strong>gen vermeld zijn <strong>in</strong> Tabel 1.<br />
Als we fig. 2 bekijken vallen een aantal zaken op. Om<br />
te beg<strong>in</strong>nen blijkt <strong>de</strong> neutrale component caffeïne<br />
(Caf), die geen eigen lad<strong>in</strong>g bezit, toch met een bepaal<strong>de</strong><br />
snelheid o.i.v. het elektrisch veld door het<br />
Figuur 2. Elektroferogrammen voor <strong>de</strong> scheid<strong>in</strong>g van een<br />
mengsel van creat<strong>in</strong><strong>in</strong>e (Cr), caffeïne (Caf) en benzoëzuur (B)<br />
gemeten on<strong>de</strong>r gebruikmak<strong>in</strong>g van een BGE op pH’s van 3,5<br />
en 5 respectievelijk. Zie tabel 1 voor meetcondities.<br />
Tabel 1. Meetcondities voor <strong>de</strong> P/ACE 5500 (Beckman)<br />
Temperatuur 30 o C<br />
Capillair lengte 0,466 m<br />
Afstand <strong>in</strong>jectie-<strong>de</strong>tectie 0,40 m<br />
Capillair diameter (I.D.) 75 µm<br />
Spann<strong>in</strong>g 15 kV<br />
(negatieve potentiaal aan <strong>de</strong>tector zij<strong>de</strong>)<br />
Injectiedruk 0,5 psi<br />
Injectiesnelheid ca. 1 mm/s<br />
Injectietijd 5 s<br />
Spoeldruk 20 psi<br />
Golflengte <strong>de</strong>tector 214 nm<br />
BGE : 0,01 mol/l Tris + azijnzuur tot pH 5; 0,01 mol/l Tris +<br />
mierenzuur tot pH 3,5<br />
systeem te migreren. Dit komt omdat hij meegevoerd<br />
wordt met <strong>de</strong> snelheid van <strong>de</strong> vloeistof, <strong>de</strong> elektroosmotische<br />
flow (EOF). Omdat hij <strong>de</strong> snelheid van <strong>de</strong><br />
EOF markeert wordt hij een EOF-marker genoemd.<br />
Uit <strong>de</strong> figuren blijkt dat <strong>de</strong> snelheid van <strong>de</strong> EOF hoger<br />
is bij hogere pH. De positief gela<strong>de</strong>n component<br />
creat<strong>in</strong><strong>in</strong>e (Cr), vertoont een kle<strong>in</strong>ere migratietijd dan<br />
<strong>de</strong> EOF-marker. Hij beweegt ook <strong>in</strong> <strong>de</strong> richt<strong>in</strong>g van<br />
<strong>de</strong> negatieve elektro<strong>de</strong> met een extra snelheid. De negatief<br />
gela<strong>de</strong>n component benzoëzuur (B) beweegt <strong>in</strong><br />
<strong>de</strong> richt<strong>in</strong>g van <strong>de</strong> positieve elektro<strong>de</strong>, maar wordt<br />
toch nog meegesleurd door <strong>de</strong> EOF. Omdat zijn eigen<br />
elektroforetische snelheid tegengesteld aan <strong>de</strong> EOF is<br />
zijn migratietijd groter dan die van <strong>de</strong> EOF-marker<br />
caffeïne. Opmerkelijk is ook <strong>de</strong> driehoekige vorm van<br />
<strong>de</strong> pieken, vooral dui<strong>de</strong>lijk zichtbaar bij het BGE op<br />
pH 5. De gela<strong>de</strong>n <strong>de</strong>eltjes creat<strong>in</strong><strong>in</strong>e en benzoëzuur<br />
vertonen smallere pieken dan <strong>de</strong> neutrale component<br />
caffeïne, ze wor<strong>de</strong>n opgescherpt (stack<strong>in</strong>g), vooral<br />
zichtbaar bij pH 3,5.<br />
Mobiliteiten en migratietij<strong>de</strong>n <strong>in</strong> CZE<br />
Von Reuss nam <strong>in</strong> zijn experimenten zowel <strong>elektroforese</strong><br />
als ook elektro-endosmose waar. Aangezien<br />
bei<strong>de</strong> fenomenen opgeteld moeten wor<strong>de</strong>n om <strong>de</strong> migratie<br />
van <strong>de</strong>eltjes <strong>in</strong> een elektrisch veld te verklaren,<br />
zullen ze nu successievelijk behan<strong>de</strong>ld wor<strong>de</strong>n.<br />
De elektroforetische mobiliteit<br />
Als men een potentiaalverschil aanlegt over twee<br />
elektro<strong>de</strong>n, die geplaatst zijn aan <strong>de</strong> uite<strong>in</strong><strong>de</strong>n van<br />
een scheid<strong>in</strong>gscapillair dat gevuld is met een elektrolytoploss<strong>in</strong>g,<br />
stelt zich <strong>in</strong> het scheid<strong>in</strong>gscapillair een<br />
elektrisch veld <strong>in</strong>. De elektrische veldsterkte E <strong>in</strong> het<br />
capillair wordt:<br />
[1]<br />
waarbij V (Volt) het aangelegd potentiaalverschil en<br />
LC (m) <strong>de</strong> capillairlengte voorstellen. Gela<strong>de</strong>n <strong>de</strong>eltjes<br />
die zich <strong>in</strong> <strong>de</strong>ze elektrolytoploss<strong>in</strong>g bev<strong>in</strong><strong>de</strong>n, gaan<br />
bewegen on<strong>de</strong>r <strong>in</strong>vloed van dit elektrische veld en<br />
krijgen een snelheid die recht evenredig is met <strong>de</strong><br />
veldsterkte E, volgens <strong>de</strong> formules:<br />
212 Ned Tijdschr Kl<strong>in</strong> Chem 2000, vol. 25, no. 4<br />
[2]
De evenredigheidsconstante m wordt <strong>de</strong> mobiliteit<br />
genoemd en stelt dus <strong>de</strong> snelheid van een gela<strong>de</strong>n<br />
component per eenheid van elektrische veldsterkte<br />
voor. Deze mobiliteit is een stofeigenschap, heeft een<br />
bepaal<strong>de</strong> constante waar<strong>de</strong> voor een bepaald elektrolytsysteem<br />
en hangt o.a. af van <strong>de</strong> grootte van het molecuul,<br />
<strong>de</strong> pK waar<strong>de</strong> van <strong>de</strong> component, <strong>de</strong> pH van het<br />
elektrolytsysteem, <strong>de</strong> viscositeit van <strong>de</strong> vloeistoffen<br />
en dus ook van <strong>de</strong> temperatuur. Bij one<strong>in</strong>dige verdunn<strong>in</strong>g<br />
(dus bij een concentratie praktisch gelijk aan<br />
nul) als er géén zgn. ionatmosfeer werkzaam is, is <strong>de</strong><br />
mobiliteit mi o afhankelijk van <strong>de</strong> lad<strong>in</strong>g q, <strong>de</strong> viscositeit<br />
η (Pa.s) van het medium en <strong>de</strong> straal r van het<br />
gehydrateerd <strong>de</strong>eltje volgens <strong>de</strong> formule:<br />
[3]<br />
Bij een bepaal<strong>de</strong> concentratie (dus bij e<strong>in</strong>dige verdunn<strong>in</strong>g)<br />
zijn ionen omr<strong>in</strong>gd door tegengesteld gela<strong>de</strong>n<br />
ionen. Deze “tegen-ionen” bewegen o.i.v. een<br />
elektrisch veld <strong>in</strong> tegengestel<strong>de</strong> richt<strong>in</strong>g. Een ion<br />
moet dus migreren tegen <strong>de</strong> hem omr<strong>in</strong>gen<strong>de</strong> tegengesteld<br />
gela<strong>de</strong>n ionen <strong>in</strong>, waardoor hij vertraagd<br />
wordt. De zwaartepunten van het ion en <strong>de</strong> hem omr<strong>in</strong>gen<strong>de</strong><br />
tegengesteld gela<strong>de</strong>n ionen vallen niet meer<br />
samen. Voor een uitvoerige beschouw<strong>in</strong>g van <strong>de</strong>ze<br />
zgn. elektroforetische en relaxatie effecten zij verwezen<br />
naar <strong>de</strong> Debye-Hückel-Onsager relaties (11). Positief<br />
gela<strong>de</strong>n <strong>de</strong>eltjes (kationen) bewegen <strong>in</strong> <strong>de</strong> richt<strong>in</strong>g<br />
van <strong>de</strong> negatieve elektro<strong>de</strong> (katho<strong>de</strong>) en negatief<br />
gela<strong>de</strong>n <strong>de</strong>eltjes (anionen) <strong>in</strong> <strong>de</strong> richt<strong>in</strong>g van <strong>de</strong> positieve<br />
elektro<strong>de</strong> (ano<strong>de</strong>). Voor kationen heeft <strong>de</strong> mobiliteit<br />
een positieve en voor anionen een negatieve<br />
waar<strong>de</strong>. De or<strong>de</strong> van grootte voor <strong>de</strong> scalaire waar<strong>de</strong>n<br />
van <strong>de</strong>ze mobiliteiten is 20 á 80×10 -9 m 2 V -1 s -1 . Bij<br />
potentiaalverschillen van 10 kV over een capillairlengte<br />
van 50 cm, leidt dit tot snelhe<strong>de</strong>n van 0,4 á 1,6<br />
mm/s, waardoor analysetij<strong>de</strong>n <strong>in</strong> <strong>de</strong> or<strong>de</strong> van grootte<br />
van 10 m<strong>in</strong>uten gebruikelijk zijn. Zwakke zuren en<br />
basen zijn niet altijd geheel geprotolyseerd, c.q. geprotoneerd,<br />
waardoor hun effectieve mobiliteit kle<strong>in</strong>er<br />
zal zijn dan hun ionmobiliteit. Bij het migreren<br />
van ge<strong>de</strong>eltelijk geprotolyseer<strong>de</strong> en dus gela<strong>de</strong>n zuren<br />
en basen moet men zich voorstellen dat <strong>de</strong> component<br />
<strong>in</strong> één zone migreert, waarbij beurtel<strong>in</strong>gs het<br />
molecuul <strong>in</strong> <strong>de</strong> gela<strong>de</strong>n c.q. ongela<strong>de</strong>n vorm aanwezig<br />
is. Men kan nooit <strong>de</strong> gela<strong>de</strong>n en ongela<strong>de</strong>n fracties<br />
van zwakke zuren en basen van elkaar schei<strong>de</strong>n,<br />
omdat het chemisch evenwicht (<strong>de</strong> protolyse snelheid)<br />
<strong>in</strong> het algemeen bedui<strong>de</strong>nd groter is dan <strong>de</strong> migratiesnelheid.<br />
Ook complexer<strong>in</strong>g kan <strong>de</strong> mobiliteit<br />
verkle<strong>in</strong>en, <strong>de</strong>nk bijvoorbeeld maar aan <strong>de</strong> <strong>in</strong>teractie<br />
tussen calcium ionen en EDTA of citraat. De effecten<br />
van <strong>de</strong> pH op het migratiegedrag kunnen <strong>in</strong>geschat<br />
wor<strong>de</strong>n door gebruik te maken van <strong>de</strong> formules:<br />
[4]<br />
In <strong>de</strong>ze formule stelt α <strong>de</strong> dissociatiegraad voor, die<br />
bepaald wordt door zowel <strong>de</strong> pH van <strong>de</strong> elektrolytoploss<strong>in</strong>g<br />
als <strong>de</strong> pK waar<strong>de</strong> van <strong>de</strong> component, volgens<br />
<strong>de</strong> formule van Hen<strong>de</strong>rson-Hasselbalch. De m c i<br />
is <strong>de</strong> ionmobiliteit bij <strong>de</strong> toegepaste concentratie.<br />
Ned Tijdschr Kl<strong>in</strong> Chem 2000, vol. 25, no. 4<br />
Figuur 3. Mobiliteiten van componenten als functie <strong>de</strong>r pH,<br />
voor verschillen<strong>de</strong> ionmobiliteiten en pK-waar<strong>de</strong>n. De relaties<br />
zijn gemarkeerd met twee getallen die <strong>de</strong> ionmobiliteit mi c en<br />
pK-waar<strong>de</strong> voorstellen. Als <strong>de</strong> pH-waar<strong>de</strong> gelijk is aan <strong>de</strong> pKwaar<strong>de</strong><br />
is <strong>de</strong> effectieve mobiliteit gelijk aan <strong>de</strong> helft van <strong>de</strong><br />
ionmobiliteit (zie stippellijn).<br />
Voor kationen wordt dus bij lage pH en voor anionen<br />
bij hoge pH <strong>de</strong> maximale waar<strong>de</strong> van <strong>de</strong> elektroforetische<br />
mobiliteit verkregen. In fig. 3 zijn <strong>de</strong> mobiliteiten<br />
van enige componenten als functie <strong>de</strong>r pH, voor<br />
verschillen<strong>de</strong> ionmobiliteiten en pK-waar<strong>de</strong>n, weergegeven.<br />
De relaties zijn gemarkeerd met twee getallen<br />
die <strong>de</strong> ionmobiliteit en pK-waar<strong>de</strong> voorstellen.<br />
Als <strong>de</strong> pH-waar<strong>de</strong> gelijk is aan <strong>de</strong> pK-waar<strong>de</strong> is <strong>de</strong><br />
effectieve mobiliteit gelijk aan <strong>de</strong> helft van <strong>de</strong> ionmobiliteit<br />
(zie stippellijn). Voor acetaat bijvoorbeeld met<br />
een ionmobiliteit van -42×10 -9 m 2 V -1 s -1 en pK-waar<strong>de</strong><br />
van 4,75 resulteert een effectieve mobiliteit bij pH<br />
4,75 van -21×10 -9 m 2 V -1 s -1 . Belangrijk <strong>in</strong> fig. 3 zijn<br />
ook <strong>de</strong> snijpunten <strong>in</strong> <strong>de</strong> curven; bij een pH van ongeveer<br />
4,5 heeft het kation met ionmobiliteit 40 en pK 5<br />
<strong>de</strong>zelf<strong>de</strong> effectieve mobiliteit als het kation met ionmobiliteit<br />
30 en pK 6. Ze vormen <strong>in</strong> een BGE met pH<br />
4,5 een mengzone terwijl ze bij een hogere of lagere<br />
pH van het BGE prima te schei<strong>de</strong>n zijn. Voor <strong>de</strong> volledigheid<br />
moet hier ook gewezen wor<strong>de</strong>n op <strong>de</strong> mogelijke<br />
remmen<strong>de</strong> <strong>in</strong>vloed op <strong>de</strong> mobiliteit van frictie<br />
en tortuositeit <strong>in</strong> een dragermateriaal met kle<strong>in</strong>e kronkelige<br />
poriën, bij bijvoorbeeld eiwit-<strong>elektroforese</strong> <strong>in</strong><br />
een gel of membraam.<br />
De EOF-mobiliteit<br />
Als men over een met een elektrolytoploss<strong>in</strong>g gevuld<br />
capillair een potentiaalverschil aanlegt, blijkt o.i.v.<br />
van het aangeleg<strong>de</strong> veld ook <strong>de</strong> vloeistof zelf te gaan<br />
bewegen: <strong>de</strong> elektro-osmotische flow (EOF). De snelheid<br />
van <strong>de</strong>ze EOF blijkt ook evenredig met <strong>de</strong> aangeleg<strong>de</strong><br />
veldsterkte te verlopen. Men hanteert daarom<br />
213
ook wel het begrip “mobiliteit” van <strong>de</strong> EOF, ge<strong>de</strong>f<strong>in</strong>ieerd<br />
als:<br />
[5]<br />
Voor silica<strong>capillaire</strong>n, die vaak bij elektroforetische<br />
technieken gebruikt wor<strong>de</strong>n, blijkt <strong>de</strong> EOF <strong>in</strong> <strong>de</strong> richt<strong>in</strong>g<br />
van <strong>de</strong> katho<strong>de</strong> te bewegen, doordat <strong>de</strong> silica<br />
wand negatief gela<strong>de</strong>n is en <strong>de</strong> aanpalen<strong>de</strong> vloeistoflaag<br />
positief. De mobiliteit van <strong>de</strong> EOF neemt toe bij<br />
hogere pH van het gebruikte BGE en varieert voor een<br />
pH van ca. 3 tot 9 van +20 tot ca. +80×10 -9 m 2 V -1 s -1<br />
voor ongecoate <strong>capillaire</strong>n. Afhankelijk van het gewenste<br />
resultaat kan <strong>de</strong> EOF al dan niet on<strong>de</strong>rdrukt of<br />
uitgeschakeld wor<strong>de</strong>n door enerzijds toevoeg<strong>in</strong>g van<br />
additieven aan het BGE zoals polyv<strong>in</strong>ylalcohol, oppervlak-aktieve<br />
stoffen als Tween of proteïnen als<br />
album<strong>in</strong>e (dynamische coat<strong>in</strong>g van <strong>de</strong> wand) of an<strong>de</strong>rzijds<br />
door chemische coat<strong>in</strong>g van <strong>de</strong> wand met “endcapp<strong>in</strong>g”<br />
van <strong>de</strong> silanolgroepen. Ook kan <strong>elektroforese</strong><br />
<strong>in</strong> kunststof <strong>capillaire</strong>n van Teflon wor<strong>de</strong>n<br />
uitgevoerd, waarbij <strong>de</strong> EOF groten<strong>de</strong>els uitgeschakeld<br />
is. Zoals we gezien hebben <strong>in</strong> fig. 2 heeft <strong>de</strong><br />
EOF een grote impact op elektroforetische processen.<br />
Zo blijken anionen (negatief gela<strong>de</strong>n <strong>de</strong>eltjes) toch <strong>in</strong><br />
<strong>de</strong> richt<strong>in</strong>g van <strong>de</strong> katho<strong>de</strong> meegesleurd te kunnen<br />
wor<strong>de</strong>n mits <strong>de</strong> mobiliteit van <strong>de</strong> EOF groter is dan<br />
die van <strong>de</strong> anionen. Dit is <strong>de</strong> re<strong>de</strong>n waarom <strong>in</strong> <strong>de</strong> <strong>capillaire</strong><br />
zone <strong>elektroforese</strong> <strong>in</strong> één experiment zowel<br />
anionen als kationen bepaald kunnen wor<strong>de</strong>n. De<br />
netto snelheid van een <strong>de</strong>eltje wordt dus bepaald door<br />
<strong>de</strong> resultante van <strong>de</strong> snelheid van het <strong>de</strong>eltje en <strong>de</strong><br />
snelheid van <strong>de</strong> EOF. De schijnbare mobiliteit of apparent<br />
mobility mapp wordt ge<strong>de</strong>f<strong>in</strong>ieerd als <strong>de</strong> sommatie<br />
van <strong>de</strong> mobiliteit van <strong>de</strong> EOF en die van het<br />
<strong>de</strong>eltje zelf. Als <strong>de</strong> apparent mobility voor een bepaal<strong>de</strong><br />
component bij het elektroforetisch proces negatief<br />
is, dus een netto beweg<strong>in</strong>g naar <strong>de</strong> positieve<br />
elektro<strong>de</strong>, zal <strong>de</strong> component nooit bij <strong>de</strong> <strong>de</strong>tector<br />
aankomen, als <strong>de</strong>ze zich aan <strong>de</strong> katho<strong>de</strong> kant bev<strong>in</strong>dt.<br />
Voor <strong>de</strong> migratietijd kan afgeleid wor<strong>de</strong>n:<br />
[6]<br />
waarbij Ld <strong>de</strong> afstand is tussen <strong>in</strong>jectie en <strong>de</strong>tectie<br />
voorstelt. M.b.v. <strong>de</strong>ze formule kunnen migratietij<strong>de</strong>n<br />
berekend wor<strong>de</strong>n uit beken<strong>de</strong> mobiliteiten of mobiliteiten<br />
uit gemeten migratietij<strong>de</strong>n.<br />
Elektroforetische uitvoer<strong>in</strong>gstechnieken<br />
Zoals al aangegeven, kunnen elektroforetische processen<br />
op verschillen<strong>de</strong> manieren wor<strong>de</strong>n uitgevoerd.<br />
Hierbij is met name van belang <strong>de</strong> keuze van het<br />
BGE <strong>in</strong> het scheid<strong>in</strong>gscompartiment <strong>in</strong> comb<strong>in</strong>atie<br />
met <strong>de</strong> samenstell<strong>in</strong>g van <strong>de</strong> elektrolyten <strong>in</strong> <strong>de</strong> elektro<strong>de</strong>ruimten.<br />
Dit alles uiteraard afgestemd op <strong>de</strong> karakteristieken<br />
van het te analyseren monster. Bovendien<br />
kunnen <strong>de</strong> verschillen<strong>de</strong> uitvoer<strong>in</strong>gstechnieken<br />
vaak nog gekoppeld wor<strong>de</strong>n of kunnen b<strong>in</strong>nen één<br />
experiment <strong>de</strong> verschillen<strong>de</strong> componenten volgens<br />
verschillen<strong>de</strong> elektroforetische pr<strong>in</strong>cipes migreren.<br />
Elektroforese is multifactorieel bepaald en daardoor<br />
soms moeilijker te begrijpen dan vloeistofchromato-<br />
Figuur 4. Isotachoforese voor kationen. (a) Het scheid<strong>in</strong>gscapillair<br />
en <strong>de</strong> katho<strong>de</strong>ruimte zijn gevuld met een lei<strong>de</strong>nd elektrolyt<br />
L terwijl <strong>de</strong> ano<strong>de</strong>ruimte gevuld wordt met het term<strong>in</strong>erend<br />
elektrolyt T. De monsteroploss<strong>in</strong>g M wordt <strong>in</strong>gebracht<br />
tussen L en T. (b) Na enige tijd zijn <strong>de</strong> monsterionen, hier Na +<br />
en Li + ionen, geschei<strong>de</strong>n en migreren met gelijke snelheid tussen<br />
het lei<strong>de</strong>nd elektrolyt KCl en term<strong>in</strong>erend elektrolyt<br />
TrisCl. (c) Gesimuleer<strong>de</strong> concentratieprofielen voor <strong>de</strong> situatie<br />
on<strong>de</strong>r (b). Let op <strong>de</strong> verhoog<strong>de</strong> concentratie aan Tris op <strong>de</strong><br />
oorspronkelijke bemonster<strong>in</strong>gsplaats. (d) Ook als er slechts<br />
een zeer kle<strong>in</strong>e hoeveelheid monstercomponent aanwezig is,<br />
migreren <strong>de</strong>ze gestackt tussen L en T. Voor ver<strong>de</strong>re <strong>in</strong>formatie<br />
zie tekst.<br />
grafie. Om <strong>de</strong> typische verschillen <strong>in</strong> migratiegedrag<br />
te <strong>de</strong>monstreren zullen we een isotachoforetisch, een<br />
zone elektroforetisch en een isoelectricfocus<strong>in</strong>g proces<br />
beschrijven, waarna <strong>de</strong> MECC mo<strong>de</strong> besproken<br />
wordt.<br />
Isotachoforese<br />
Bij isotachoforese (ITP) kunnen <strong>in</strong> één experiment,<br />
slechts kationen óf anionen geschei<strong>de</strong>n wor<strong>de</strong>n. Voor<br />
<strong>de</strong> scheid<strong>in</strong>g van kationen wor<strong>de</strong>n het scheid<strong>in</strong>gscapillair<br />
en <strong>de</strong> katho<strong>de</strong>ruimte gevuld met een zogenaamd<br />
lei<strong>de</strong>nd elektrolyt (L), zie fig. 4. De ano<strong>de</strong>ruimte<br />
wordt gevuld met het term<strong>in</strong>erend elektrolyt<br />
(T). Het kation van L dient een mobiliteit te bezitten<br />
groter dan <strong>de</strong> mobiliteit van <strong>de</strong> te schei<strong>de</strong>n kationen<br />
<strong>in</strong> het monster. De mobiliteit van het kation van T<br />
dient kle<strong>in</strong>er te zijn dan die van <strong>de</strong> monsterkationen.<br />
Als men <strong>de</strong> monstercomponenten <strong>in</strong>brengt tussen L<br />
en T, dan blijven <strong>de</strong> monstercomponenten ook tussen<br />
L en T migreren en wor<strong>de</strong>n uite<strong>in</strong><strong>de</strong>lijk geschei<strong>de</strong>n.<br />
In fig. 4 (a) is <strong>de</strong> uitgangstoestand weergegeven voor<br />
<strong>de</strong> scheid<strong>in</strong>g van een mengsel van 0,01 mol/l Na + en<br />
Li + met een lei<strong>de</strong>nd elektrolyt 0,01 mol/l KCl en term<strong>in</strong>erend<br />
elektrolyt 0,01 mol/l TrisCl. In fig. 4 (b) is<br />
<strong>de</strong> toestand <strong>in</strong> het capillair na enige tijd weergegeven,<br />
214 Ned Tijdschr Kl<strong>in</strong> Chem 2000, vol. 25, no. 4
waarbij <strong>de</strong> geschei<strong>de</strong>n componenten Na + en Li + migreren<br />
<strong>in</strong> aansluiten<strong>de</strong> aparte zones, gerangschikt<br />
naar afnemen<strong>de</strong> mobiliteit tussen het lei<strong>de</strong>nd ion K +<br />
en het term<strong>in</strong>erend ion Tris + . In fig. 4 (c) zijn <strong>de</strong> met<br />
een simulatieprogramma bereken<strong>de</strong> concentratieprofielen<br />
voor <strong>de</strong> kationen weergegeven, berekend voor<br />
<strong>de</strong> on<strong>de</strong>r (b) beschreven scheid<strong>in</strong>g. Dui<strong>de</strong>lijk is te<br />
zien dat <strong>de</strong> concentraties <strong>in</strong> <strong>de</strong> Na + ,Li + en Tris + zones<br />
achter <strong>de</strong> K + zone aangepast zijn aan die van het<br />
lei<strong>de</strong>nd ion K + volgens <strong>de</strong> Kohlrausch regulat<strong>in</strong>g<br />
function (KRF), die later nog wordt besproken. Voor<br />
lagere mobiliteiten stellen zich lagere concentraties<br />
<strong>in</strong>. Op <strong>de</strong> oorspronkelijke bemonster<strong>in</strong>gsplaats, was<br />
<strong>de</strong> totale concentratie aan ionen 0,02 mol/l en men<br />
ziet dat zich daar ter plaatse een Tris + concentratie<br />
van ca. 0,018 mol/lheeft <strong>in</strong>gesteld, terwijl op <strong>de</strong> oorspronkelijke<br />
plaats van T <strong>de</strong> concentratie aan Tris +<br />
0,01 mol/l gebleven is. Alle zones bevatten slechts<br />
één soort kationen. In fig. 4 (d) is <strong>de</strong> ITP-simulatie<br />
weergegeven voor <strong>de</strong>zelf<strong>de</strong> ionsoorten als die <strong>in</strong> fig. 4<br />
(c), met dien verstan<strong>de</strong> dat slechts een kle<strong>in</strong>e hoeveelheid<br />
monster is <strong>in</strong>gebracht. Men ziet nu dat er niet<br />
voldoen<strong>de</strong> monster aanwezig is om volgens <strong>de</strong> KRF<br />
geconcentreerd te kunnen wor<strong>de</strong>n tot <strong>de</strong> aangepaste<br />
concentratie en dat dit tot zeer kle<strong>in</strong>e zonelengten<br />
leidt (zie <strong>de</strong> vergrootte <strong>in</strong>zet), maar <strong>de</strong> monstercomponenten<br />
blijven op hoge concentratie, als vrij<br />
scherpe stabiele zones migreren <strong>in</strong>geklemd tussen<br />
aangrenzen<strong>de</strong> grotere zones. Door <strong>de</strong>ze eigenschap<br />
wordt ITP vaak toegepast als pre-concentratiestap<br />
voor verdun<strong>de</strong> monsteroploss<strong>in</strong>gen, waarna men door<br />
Figuur 5. Capillaire zone <strong>elektroforese</strong>. (a) Het gehele apparaat<br />
wordt gevuld met eenzelf<strong>de</strong> achtergron<strong>de</strong>lektrolyt (BGE).<br />
De monsteroploss<strong>in</strong>g M wordt <strong>in</strong>gebracht <strong>in</strong> dit BGE. (b) Na<br />
enige tijd wor<strong>de</strong>n <strong>de</strong> monstercomponenten geschei<strong>de</strong>n. De<br />
niet-gela<strong>de</strong>n component 2, beweegt met <strong>de</strong> snelheid van <strong>de</strong><br />
EOF. De positieve ionen 1, bewegen sneller dan <strong>de</strong> EOF terwijl<br />
<strong>de</strong> negatieve ionen 3 toch richt<strong>in</strong>g katho<strong>de</strong> wor<strong>de</strong>n meegesleurd<br />
mits <strong>de</strong> mobiliteit van EOF groter is dan die van <strong>de</strong> negatieve<br />
ionen zelf. Voor ver<strong>de</strong>re <strong>in</strong>formatie zie tekst.<br />
Ned Tijdschr Kl<strong>in</strong> Chem 2000, vol. 25, no. 4<br />
wissel<strong>in</strong>g van elektrolyten het scheid<strong>in</strong>gsproces laat<br />
voltrekken volgens CZE. Men spreekt <strong>in</strong> zo’n geval<br />
dan van transient ITP of gekoppeld ITP-CZE.<br />
Capillaire zone <strong>elektroforese</strong><br />
Bij zone <strong>elektroforese</strong> wordt het gehele scheid<strong>in</strong>gssysteem,<br />
<strong>in</strong>clusief elektro<strong>de</strong>ruimten, gevuld met het<br />
zogenaam<strong>de</strong> backgroun<strong>de</strong>lektrolyt of BGE. Bij toepass<strong>in</strong>g<br />
van een elektrische stroom door dit systeem<br />
zal dus overal een vrijwel constante elektrische veldsterkte<br />
heersen. Componenten die <strong>in</strong> dit systeem wor<strong>de</strong>n<br />
<strong>in</strong>gebracht, zullen dus elk met een eigen snelheid,<br />
bepaald door hun karakteristieke mobiliteit,<br />
gaan migreren en aldus geschei<strong>de</strong>n wor<strong>de</strong>n. In fig. 5<br />
is schematisch dit zone elektroforetisch pr<strong>in</strong>cipe<br />
weergegeven. In fig. 5 (a) is <strong>de</strong> beg<strong>in</strong>situatie gegeven<br />
waarbij het gehele apparaat wordt gevuld met eenzelf<strong>de</strong><br />
BGE. De monsteroploss<strong>in</strong>g M wordt <strong>in</strong>gebracht<br />
<strong>in</strong> dit BGE. In fig. 5 (b) is <strong>de</strong> situatie na enige<br />
tijd weergegeven. De monstercomponenten migreren<br />
elk met hun eigen typische snelheid, bepaald door<br />
hun apparent mobiliteit en veldsterkte en wor<strong>de</strong>n<br />
aldus geschei<strong>de</strong>n. De niet-gela<strong>de</strong>n component 2, beweegt<br />
met <strong>de</strong> snelheid van <strong>de</strong> EOF. De positieve<br />
ionen 1, bewegen sneller dan <strong>de</strong> EOF terwijl <strong>de</strong> negatieve<br />
ionen 3 toch richt<strong>in</strong>g katho<strong>de</strong> wor<strong>de</strong>n meegesleurd<br />
mits <strong>de</strong> mobiliteit van EOF groter is dan die<br />
van <strong>de</strong> negatieve ionen zelf. Het elektroferogram is <strong>in</strong><br />
fig. 5 (c) gegeven.<br />
Isoelectricfocus<strong>in</strong>g<br />
Deze techniek is <strong>in</strong> feite alleen geschikt voor monstercomponenten,<br />
welke zowel positief als negatief<br />
gela<strong>de</strong>n kunnen zijn: amfolieten. Omdat proteïnen<br />
amfolieten zijn, anion bij neutrale en hoge pH en kation<br />
bij lage pH, wordt <strong>de</strong>ze techniek vaak <strong>in</strong>gezet<br />
voor scheid<strong>in</strong>g van proteïnen. Men spreekt ook van<br />
scheid<strong>in</strong>g op pI-waar<strong>de</strong> omdat <strong>in</strong> <strong>de</strong> e<strong>in</strong>dfase van het<br />
elektroforetisch proces, <strong>de</strong> monstercomponenten gerangschikt<br />
volgens hun pI-waar<strong>de</strong>, <strong>in</strong>gebed zijn <strong>in</strong> een<br />
gestabiliseer<strong>de</strong> pH-gradiënt b<strong>in</strong>nen het scheid<strong>in</strong>gscompartiment.<br />
Bij <strong>capillaire</strong> isoelectric focus<strong>in</strong>g (CIEF)<br />
wordt <strong>in</strong> het capillair allereerst een pH-gradiënt opgebouwd<br />
met behulp van een mengsel synthetische<br />
amfolieten van een bepaal<strong>de</strong> pH-range, bijvoorbeeld<br />
van 5 tot 6. Het monster wordt tezamen met <strong>de</strong> synthetische<br />
amfolieten geïnjecteerd, waarna <strong>de</strong> scheid<strong>in</strong>g<br />
plaats kan v<strong>in</strong><strong>de</strong>n. De lage pH zij<strong>de</strong> van <strong>de</strong> gradiënt<br />
bev<strong>in</strong>dt zich aan <strong>de</strong> kant van <strong>de</strong> ano<strong>de</strong>. Tenslotte<br />
wordt <strong>de</strong> hele pH-gradiënt, <strong>in</strong>clusief <strong>de</strong> <strong>in</strong>gebed<strong>de</strong><br />
monstercomponenten, mid<strong>de</strong>ls druk langs <strong>de</strong> <strong>de</strong>tector<br />
gevoerd. In pr<strong>in</strong>cipe kan <strong>in</strong> plaats van gasdruk, ook<br />
<strong>de</strong> EOF benut wor<strong>de</strong>n als pomp. In <strong>de</strong> praktijk is<br />
CIEF moeilijk te hanteren en er zal hier dan ook niet<br />
ver<strong>de</strong>r op wor<strong>de</strong>n <strong>in</strong>gegaan, ofschoon ze voor <strong>de</strong> ervaren<br />
“homo elektroforeticus” zeer nuttig kan zijn als<br />
alternatief voor IEF <strong>in</strong> gels.<br />
Micellaire elektrok<strong>in</strong>etische <strong>capillaire</strong> chromatografie<br />
Door <strong>de</strong> groep van Terabe is <strong>de</strong> micellaire elektrok<strong>in</strong>etische<br />
<strong>capillaire</strong> chromatografie (MECC) geïntroduceerd,<br />
die beschouwd kan wor<strong>de</strong>n als een<br />
“hybri<strong>de</strong>” scheid<strong>in</strong>gstechniek, waarbij het elektro-<br />
215
Figuur 6. In MECC is aan het achtergron<strong>de</strong>lektrolyt een surfactant<br />
toegevoegd waardoor negatief gela<strong>de</strong>n micellen gevormd<br />
wor<strong>de</strong>n. Als <strong>de</strong> snelheid van <strong>de</strong> EOF groter is dan die<br />
van <strong>de</strong> negatieve micellen bewegen <strong>de</strong>ze toch naar <strong>de</strong> negatieve<br />
elektro<strong>de</strong>. Neutrale componenten die <strong>in</strong> <strong>de</strong> micellen oplossen<br />
zullen dus ook richt<strong>in</strong>g negatieve elektro<strong>de</strong> bewegen. Voor ver<strong>de</strong>re<br />
<strong>in</strong>formatie zie tekst.<br />
foretische en chromatografische scheid<strong>in</strong>gspr<strong>in</strong>cipe<br />
gecomb<strong>in</strong>eerd zijn. Met <strong>de</strong>ze metho<strong>de</strong> kunnen ook<br />
neutrale componenten bepaald wor<strong>de</strong>n, dit ter on<strong>de</strong>rscheid<br />
met <strong>de</strong> gewone elektroforetische scheid<strong>in</strong>gstechniek.<br />
Het pr<strong>in</strong>cipe bij MECC is dat men aan het<br />
achtergron<strong>de</strong>lektrolyt een micelvormer (surfactant)<br />
toevoegt op een concentratie boven <strong>de</strong> zgn. kritische<br />
micelconcentratie (CMC). Er wor<strong>de</strong>n dus micellen<br />
gevormd die <strong>in</strong>wendig hydrofoob zijn en waarvan <strong>de</strong><br />
buitenkant hydrofiel is, door <strong>de</strong> <strong>in</strong> <strong>de</strong> micel-vormer<br />
aanwezige gela<strong>de</strong>n functionele groepen. De micellen<br />
verkeren <strong>in</strong> een dynamisch evenwicht met <strong>de</strong> monomeren<br />
van <strong>de</strong> micel-vormer. Vaak gebruikt men als<br />
micel-vormers <strong>de</strong> negatief gela<strong>de</strong>n do<strong>de</strong>cylsulfaat ionen<br />
(uit SDS) of <strong>de</strong> positief gela<strong>de</strong>n cetyltrimethylammonium<br />
ionen (uit CTAB). De gevorm<strong>de</strong> micellen<br />
zullen door hun lad<strong>in</strong>g migreren met een door het<br />
elektrolytsysteem bepaal<strong>de</strong> mobiliteit. Het elektrolytsysteem<br />
<strong>in</strong> MECC bestaat dus uit twee mobiele fasen,<br />
namelijk <strong>de</strong> waterige en <strong>de</strong> micellaire fase.<br />
Voor <strong>de</strong> volgen<strong>de</strong> beschouw<strong>in</strong>g nemen we aan dat we<br />
silica <strong>capillaire</strong>n gebruiken, waarvan <strong>de</strong> mobiliteit<br />
van <strong>de</strong> EOF groter is dan <strong>de</strong> absolute waar<strong>de</strong> van die<br />
van negatief gela<strong>de</strong>n micellen. We krijgen dan <strong>de</strong> situatie<br />
zoals geschetst <strong>in</strong> fig. 6. De gevorm<strong>de</strong> micellen<br />
zullen naar <strong>de</strong> positieve elektro<strong>de</strong> bewegen met een<br />
bepaal<strong>de</strong> snelheid vmc. Als <strong>de</strong> capillairwand uit silica<br />
bestaat, zal er een EOF richt<strong>in</strong>g negatieve elektro<strong>de</strong><br />
optre<strong>de</strong>n. Als <strong>de</strong> snelheid van <strong>de</strong> EOF (Veof) groter is<br />
dan <strong>de</strong> die van <strong>de</strong> tegengesteld gerichte snelheid van<br />
<strong>de</strong> micellen, wor<strong>de</strong>n <strong>de</strong>ze toch richt<strong>in</strong>g negatieve<br />
elektro<strong>de</strong> getransporteerd. Neutrale componenten die<br />
<strong>in</strong> bepaal<strong>de</strong> mate opgelost zijn <strong>in</strong> <strong>de</strong> micellaire fase,<br />
Figuur 7. Schematische voorstell<strong>in</strong>g van een elektroferogram<br />
voor componenten, gemeten <strong>in</strong> <strong>de</strong> MECC mo<strong>de</strong>. Neutrale<br />
componenten bewegen altijd tussen <strong>de</strong> tEOF-en <strong>de</strong> tMC-marker.<br />
Positieve ionen bewegen vóór <strong>de</strong> tMC-marker en <strong>de</strong> negatieve<br />
ionen na <strong>de</strong> tEOF-marker. Voor ver<strong>de</strong>re <strong>in</strong>formatie zie tekst.<br />
zullen dus ook richt<strong>in</strong>g negatieve elektro<strong>de</strong> bewegen.<br />
Men kan dus aan neutrale componenten <strong>in</strong> MECC<br />
een zgn. pseudo-mobiliteit toekennen, die o.a. afhangt<br />
van <strong>de</strong> mobiliteit van <strong>de</strong> micellen. Als neutrale<br />
<strong>de</strong>eltjes met een an<strong>de</strong>re ver<strong>de</strong>l<strong>in</strong>gscoëfficiënt over <strong>de</strong><br />
micellaire en waterige fase ver<strong>de</strong>eld zijn en dus een<br />
an<strong>de</strong>re pseudo-mobiliteit bezitten zijn ze <strong>in</strong> <strong>de</strong><br />
MECC-mo<strong>de</strong> te schei<strong>de</strong>n. In fig. 7 zijn <strong>de</strong> verschillen<strong>de</strong><br />
mogelijkhe<strong>de</strong>n van migratiegedrag <strong>in</strong> MECC<br />
weergegeven. Positieve ionen die geen <strong>in</strong>teractie met<br />
<strong>de</strong> micellen aangaan zullen migreren voor <strong>de</strong> teof, maar<br />
als ze wel een <strong>in</strong>teractie aangaan met <strong>de</strong> micellen kunnen<br />
ze vertraagd wor<strong>de</strong>n waardoor het migratietijds<strong>in</strong>terval<br />
voor kationen loopt van t=0 tot tmc. Het mi-<br />
gratietijds<strong>in</strong>terval voor anionen loopt van teof tot t= .<br />
Voor neutrale componenten loopt het migratietijds<strong>in</strong>terval<br />
van teof (geen <strong>in</strong>teractie met micellen) tot<br />
tmc(volledige <strong>in</strong>teractie met micellen).<br />
Bijzon<strong>de</strong>re kenmerken van CZE<br />
Elektroforetische processen wor<strong>de</strong>n gereguleerd door<br />
enige fysisch-chemische wetten en kunnen beschreven<br />
wor<strong>de</strong>n door een beperkt aantal mathematische<br />
relaties. Naast <strong>de</strong> chemische evenwichtsvoorwaar<strong>de</strong>n,<br />
massabalansen en <strong>de</strong> elektroneutraliteitsvoorwaar<strong>de</strong>,<br />
zijn <strong>de</strong> gemodificeer<strong>de</strong> wet van Ohm en <strong>de</strong> “regulat<strong>in</strong>g<br />
function” van Kohlrausch belangrijk, omdat met<br />
<strong>de</strong>ze wetten vele facetten en merkwaardige verschijnselen<br />
<strong>in</strong> elektroforetische processen doorzien en verklaard<br />
kunnen wor<strong>de</strong>n. Ook kunnen elektroforetische<br />
scheid<strong>in</strong>gsprocessen gesimuleerd wor<strong>de</strong>n uitgaan<strong>de</strong><br />
van <strong>de</strong>ze mathematische relaties. In <strong>de</strong>ze paragraaf<br />
gaan we eerst <strong>de</strong> gemodificeer<strong>de</strong> wet van Ohm en <strong>de</strong><br />
Kohlrausch regulat<strong>in</strong>g function bekijken, waarna we<br />
beknopt <strong>de</strong> <strong>in</strong>directe UV-mo<strong>de</strong>, het stack<strong>in</strong>g mechanisme<br />
en <strong>de</strong> piekvorm zullen bespreken.<br />
De gemodificeer<strong>de</strong> wet van Ohm<br />
De weerstand van een gelei<strong>de</strong>r kan berekend wor<strong>de</strong>n<br />
met <strong>de</strong> formule:<br />
216 Ned Tijdschr Kl<strong>in</strong> Chem 2000, vol. 25, no. 4<br />
8<br />
[7]
waarbij ρ (Ωm) <strong>de</strong> specifieke weerstand van het materiaal,<br />
L (m) <strong>de</strong> lengte en A (m 2 ) <strong>de</strong> doorsne<strong>de</strong> van<br />
<strong>de</strong> draad voorstellen. Voor een met elektrolyt gevuld<br />
capillair geldt <strong>de</strong>zelf<strong>de</strong> relatie en gecomb<strong>in</strong>eerd met<br />
<strong>de</strong> wet van Ohm verkrijgt men dan:<br />
Ned Tijdschr Kl<strong>in</strong> Chem 2000, vol. 25, no. 4<br />
[8]<br />
Deze laatste formule is <strong>de</strong> zogenaam<strong>de</strong> gemodificeer<strong>de</strong><br />
wet van Ohm. In <strong>de</strong>ze formule is σ (Ω -1 m -1 )<br />
<strong>de</strong> specifieke geleidbaarheid, E <strong>de</strong> elektrische veldsterkte<br />
en j <strong>de</strong> stroomdichtheid. Aannemen<strong>de</strong> dat er<br />
nergens lad<strong>in</strong>gsopeenhop<strong>in</strong>g plaats v<strong>in</strong>dt, is op elk<br />
moment <strong>in</strong> elk punt van een gelei<strong>de</strong>r <strong>de</strong> stroomdichtheid<br />
j constant. Uit <strong>de</strong> gemodificeer<strong>de</strong> wet van<br />
Ohm volgt dan, dat op plaatsen met een hogere specifieke<br />
geleidbaarheid <strong>de</strong> locale veldsterkte lager is en<br />
v.v.<br />
Kohlrausch regulat<strong>in</strong>g function<br />
Een elektrolyt vertoont bij stroomdoorgang, <strong>in</strong> afwezigheid<br />
van convectie, als het ware een geheugen.<br />
Belangrijke karakteristieken op een bepaal<strong>de</strong> plaats<br />
wor<strong>de</strong>n bepaald (gereguleerd) door <strong>de</strong> karakteristieken<br />
van het oorspronkelijk aanwezige elektrolyt. De<br />
Kohlrausch regulat<strong>in</strong>g function (KRF) schrijft voor<br />
dat <strong>de</strong> numerieke waar<strong>de</strong> ω op elke plaats <strong>in</strong> het<br />
scheid<strong>in</strong>gscapillair constant is geduren<strong>de</strong> een elektroforetisch<br />
proces en gelijk blijft aan <strong>de</strong> <strong>in</strong>itiële waar<strong>de</strong><br />
van vóór het aanleggen van een elektrische stroom.<br />
Voor volledig geïoniseer<strong>de</strong> monovalente ionaire componenten,<br />
is <strong>de</strong> ω ge<strong>de</strong>f<strong>in</strong>iëerd als:<br />
[9]<br />
waarbij <strong>de</strong> ci en mi staan voor <strong>de</strong> ionenconcentraties<br />
en effectieve mobiliteiten van <strong>de</strong> ionen. Het feit dat<br />
<strong>de</strong> plaatsbepaal<strong>de</strong> waar<strong>de</strong>n voor <strong>de</strong> ω constant blijven<br />
geduren<strong>de</strong> het gehele elektroforetisch proces leidt tot<br />
enige opmerkelijke kenmerken van elektroforetische<br />
processen.<br />
Gevolgen van KRF<br />
De gevolgen van KRF zijn:<br />
- Als een monsteroploss<strong>in</strong>g met afwijken<strong>de</strong> ω<br />
waar<strong>de</strong> wordt geïnjecteerd <strong>in</strong> een BGE, blijft op <strong>de</strong><br />
plaats van bemonster<strong>in</strong>g <strong>de</strong>ze ω-waar<strong>de</strong> geldig geduren<strong>de</strong><br />
het hele elektroforetisch proces. Dit leidt<br />
tot <strong>de</strong> zgn. EOF- of “water-dip” <strong>in</strong> elektroferogrammen.<br />
- Monstercomponenten, <strong>in</strong>gebracht op lage concentratie,<br />
wor<strong>de</strong>n geconcentreerd zodra ze migreren <strong>in</strong><br />
het BGE-compartiment <strong>in</strong> een mate afhankelijk<br />
van mobiliteit en concentratie van <strong>de</strong> BGE-ionen.<br />
Dit leidt tot <strong>de</strong> zgn. “stack<strong>in</strong>g”.<br />
- Na concentrer<strong>in</strong>g gaan <strong>de</strong> monstercomponenten<br />
migreren <strong>in</strong> <strong>de</strong> zone elektroforetische mo<strong>de</strong>. De<br />
zones wor<strong>de</strong>n steeds bre<strong>de</strong>r door diverse piekverbred<strong>in</strong>gseffecten<br />
en <strong>de</strong> monsterconcentraties wor<strong>de</strong>n<br />
steeds lager. Kenmerkend is dat <strong>de</strong>ze piekverbred<strong>in</strong>g<br />
vaak overwegend aan één zij<strong>de</strong> optreedt,<br />
door <strong>de</strong> zgn. elektrodispersie, waardoor <strong>de</strong> pieken<br />
driehoekig zijn.<br />
Indirecte UV-mo<strong>de</strong><br />
Bij <strong>elektroforese</strong> apparatuur wordt vaak gebruik gemaakt<br />
van UV-<strong>de</strong>tectoren, hetgeen betekent dat UVtransparante<br />
componenten niet door <strong>de</strong> <strong>de</strong>tector waargenomen<br />
zullen wor<strong>de</strong>n. Om toch UV-transparante<br />
componenten met een UV-<strong>de</strong>tector te kunnen <strong>de</strong>tecteren<br />
kan <strong>de</strong> zogenaam<strong>de</strong> <strong>in</strong>directe UV-mo<strong>de</strong> toegepast<br />
wor<strong>de</strong>n. Bij <strong>de</strong> <strong>in</strong>directe UV-mo<strong>de</strong> wordt een BGE<br />
toegepast, waarvan het co-ion wél UV-absorberend is.<br />
Het co-ion is het BGE-ion met <strong>de</strong>zelf<strong>de</strong> soort lad<strong>in</strong>g<br />
als <strong>de</strong> te schei<strong>de</strong>n monsterionen. In een monsterzone<br />
zitten m<strong>in</strong><strong>de</strong>r co-ionen dan <strong>in</strong> het BGE zelf, omdat<br />
co-ionen vervangen zijn door monsterionen. De juiste<br />
concentraties kunnen met <strong>de</strong> KRF berekend wor<strong>de</strong>n<br />
(12) en hierbij blijkt dat <strong>in</strong> het algemeen geen één-opéén<br />
vervang<strong>in</strong>g zal optre<strong>de</strong>n. Als we het UV-signaal<br />
bekijken, zal <strong>in</strong> het segment waar <strong>de</strong> monsterionen<br />
aanwezig zijn, en dus m<strong>in</strong><strong>de</strong>r UV-absorberen<strong>de</strong> coionen,<br />
een verlaag<strong>de</strong> UV-absorptie waargenomen<br />
wor<strong>de</strong>n. De monsterzones verschijnen dus als een dip<br />
<strong>in</strong> het elektroferogram (“negatieve UV-piek”), die<br />
vaak driekantig van vorm is.<br />
Stack<strong>in</strong>g (concentrer<strong>in</strong>g) <strong>in</strong> CZE<br />
Bij elektroforetische processen nemen <strong>de</strong> analiet (te<br />
meten monstercomponent) concentraties af geduren<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> migratie, door <strong>de</strong> diverse piekverbred<strong>in</strong>gseffecten<br />
b<strong>in</strong>nen <strong>de</strong> monsterzones, net als bij chromatografische<br />
technieken. Uitgaan<strong>de</strong> van <strong>de</strong> gebruikelijke<br />
monsterconcentraties zou dit tot problemen lei<strong>de</strong>n,<br />
omdat <strong>de</strong> m<strong>in</strong>imaal aantoonbare concentratie aan <strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>tector al vrij hoog is, vanwege <strong>de</strong> zeer ger<strong>in</strong>ge optische<br />
weglengte <strong>in</strong> <strong>de</strong> <strong>de</strong>tector (<strong>in</strong> <strong>de</strong> or<strong>de</strong> van grootte<br />
van <strong>de</strong> capillairdiameter). Gelukkig kunnen tij<strong>de</strong>ns <strong>de</strong><br />
<strong>elektroforese</strong> <strong>de</strong> monstercomponenten geconcentreerd<br />
wor<strong>de</strong>n (stack<strong>in</strong>g). De meest simpele stack<strong>in</strong>g proce-<br />
Figuur 8. Bij sample stack<strong>in</strong>g kan een monster M <strong>in</strong>gebracht<br />
wor<strong>de</strong>n op een verlaag<strong>de</strong> ionsterkte. In <strong>de</strong> monsterzone M zal<br />
dus een hogere veldsterkte EM heersen dan <strong>in</strong> het BGE. De<br />
monsterionen zullen zich dus concentreren tussen <strong>de</strong> oorspronkelijke<br />
bemonster<strong>in</strong>gsplaats en het BGE, waarna ze geschei<strong>de</strong>n<br />
wor<strong>de</strong>n volgens het zone elektroforetisch pr<strong>in</strong>cipe. Voor<br />
ver<strong>de</strong>re <strong>in</strong>formatie zie tekst.<br />
217
Figuur 9. Als monsterionen een grotere mobiliteit hebben dan<br />
<strong>de</strong> co-ionen, is <strong>de</strong> specifieke geleidbaarheid <strong>in</strong> <strong>de</strong> monsterzone<br />
groter dan die van het BGE en is <strong>de</strong> locale E kle<strong>in</strong>er. (a) De<br />
monsterzone is aan <strong>de</strong> voorzij<strong>de</strong> niet zelf-corrigerend (NZC)<br />
en vertoont front<strong>in</strong>g, zie ook piek 1 <strong>in</strong> fig. 5 (c). Als <strong>de</strong><br />
monsterionen kle<strong>in</strong>ere mobiliteiten bezitten dan het BGE coion<br />
(b) is <strong>de</strong> voorzij<strong>de</strong> zelf-corrigerend (ZC) en zijn <strong>de</strong> zones<br />
tailend. Voor ver<strong>de</strong>re toelicht<strong>in</strong>g zie tekst.<br />
dure (13) bestaat uit <strong>de</strong> <strong>in</strong>jectie van verdun<strong>de</strong> monsteroploss<strong>in</strong>g.<br />
In wezen wordt bij stack<strong>in</strong>g een concentrer<strong>in</strong>g<br />
verkregen omdat <strong>de</strong> monstercomponenten<br />
moeten voldoen aan <strong>de</strong> KRF, zie fig. 8. (a) Het monster<br />
is op lage ionsterkte <strong>in</strong>gebracht met een lengte l,<br />
op <strong>de</strong> bemonster<strong>in</strong>gsplaats M. (b) Door <strong>de</strong> lage specifieke<br />
geleidbaarheid op <strong>de</strong> bemonster<strong>in</strong>gsplaats M,<br />
zal ter plaatse volgens <strong>de</strong> wet van Ohm een hoge<br />
veldsterkte heersen. (c) Daardoor migreren <strong>de</strong> monsterionen<br />
X en Y met zeer grote snelheid uit <strong>de</strong> bemonster<strong>in</strong>gsplaats<br />
en komen dan terecht <strong>in</strong> het BGE<br />
waar een veel lagere veldsterkte heerst. Ze verliezen<br />
dus aanzienlijk aan snelheid en zullen zich dus concentreren<br />
tussen <strong>de</strong> oorspronkelijke bemonster<strong>in</strong>gsplaats<br />
M en het BGE. (d) Vervolgens wor<strong>de</strong>n ze zone<br />
elektroforetisch geschei<strong>de</strong>n. Te lange geïnjecteer<strong>de</strong><br />
monsterpluggen op te lage concentraties lei<strong>de</strong>n tot<br />
verlies aan resolutie (13).<br />
De piekvorm : front<strong>in</strong>g of tail<strong>in</strong>g<br />
In <strong>elektroforese</strong> zijn <strong>in</strong> het algemeen <strong>de</strong> gemeten zones<br />
niet gaussisch maar driehoekig van vorm. De re<strong>de</strong>n<br />
hiervoor is dat een <strong>de</strong>r grensvlakken tussen monsterzone<br />
en BGE een zogenaamd zelf-corrigerend vermogen<br />
heeft om het grensvlak te stabiliseren, terwijl het<br />
an<strong>de</strong>re grensvlak diffuus wordt. Dit kan verklaard<br />
wor<strong>de</strong>n als volgt, zie fig. 9 (a). Als <strong>de</strong> mobiliteit van<br />
het monsterion groter is dan die van het co-ion, dat<br />
ge<strong>de</strong>eltelijk wordt verdrongen <strong>in</strong> <strong>de</strong> monsterzone, is<br />
<strong>de</strong> specifieke geleidbaarheid <strong>in</strong> <strong>de</strong> monsterzone groter<br />
dan die <strong>in</strong> het BGE waardoor <strong>de</strong> locale E ter plaatse<br />
kle<strong>in</strong>er is. Als nu een monsterion, door een of an<strong>de</strong>re<br />
re<strong>de</strong>n achterblijft, komt hij <strong>in</strong> <strong>de</strong> hogere veldsterkte<br />
van het BGE terecht, krijgt daardoor een grotere snelheid<br />
en bereikt weer zijn eigen zone. Dit grensvlak is<br />
dus zelf-corrigerend (ZC). Als een monsterion voorijlt<br />
op zijn zone, komt hij ook terecht <strong>in</strong> een hogere<br />
veldsterkte, krijgt dus een nog grotere snelheid en zal<br />
dus vooruit blijven, dus een niet zelf-corrigerend<br />
(NZC) grensvlak. Dit proces aan <strong>de</strong> voorkant blijft<br />
doorgaan, waardoor <strong>de</strong>ze zones driehoekig zijn en<br />
diffuus aan <strong>de</strong> voorzij<strong>de</strong> (front<strong>in</strong>g). Men noemt <strong>de</strong>ze<br />
vorm van piekverbred<strong>in</strong>g elektrodispersie. Het omgekeer<strong>de</strong><br />
v<strong>in</strong>dt plaats als het monsterion een kle<strong>in</strong>ere<br />
mobiliteit bezit dan het co-ion, zie fig. 9 (b). Als het<br />
ion achterblijft, komt het terecht <strong>in</strong> een gebied met<br />
lagere veldsterkte, het ion wordt vertraagd en blijft<br />
achter. Er ontstaat een diffuse achterzij<strong>de</strong> met een<br />
niet zelf-corrigerend (NZC) grensvlak; dit noemen<br />
we tail<strong>in</strong>g. IJlt een ion naar voren, dan komt het terecht<br />
<strong>in</strong> een lagere veldsterkte en wordt weer <strong>in</strong>gehaald<br />
door zijn eigen zone. Voor componenten, waarvan<br />
<strong>de</strong> mobiliteit gelijk is aan die van het co-ion, is<br />
<strong>de</strong> locale veldsterkte gelijk aan die van het BGE.<br />
Zo’n component vertoont geen elektrodispersie, maar<br />
vertoont slechts piekverbred<strong>in</strong>g door diffusie en is<br />
dus ook smaller. Tene<strong>in</strong><strong>de</strong> smalle hoge pieken te verkrijgen<br />
(optimale <strong>de</strong>tectie) is het dus raadzaam om<br />
een BGE te kiezen waarvan <strong>de</strong> mobiliteit van het coion<br />
<strong>in</strong> <strong>de</strong> buurt ligt van <strong>de</strong> belangrijkste analieten.<br />
Conclusie<br />
Ofschoon <strong>de</strong> eerste waarnem<strong>in</strong>gen van het verschijnsel<br />
<strong>elektroforese</strong> al bijna 200 jaar gele<strong>de</strong>n beschreven<br />
zijn en Kohlrausch <strong>de</strong> grondslagen van elektroforetische<br />
processen al meer dan 100 jaar gele<strong>de</strong>n mathematisch<br />
formuleer<strong>de</strong> (18) wordt het pr<strong>in</strong>cipe van<br />
<strong>elektroforese</strong> als scheid<strong>in</strong>gstechniek pas een vijftigtal<br />
jaren gebruikt. De Capillaire <strong>elektroforese</strong> <strong>in</strong> zijn verschillen<strong>de</strong><br />
verschijn<strong>in</strong>gsvormen is met behulp van <strong>de</strong><br />
mo<strong>de</strong>rne <strong>in</strong>strumentele mogelijkhe<strong>de</strong>n zelfs pas geduren<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> laatste 20 jaar zodanig ver<strong>de</strong>r ontwikkeld,<br />
dat ze nu op vele gebie<strong>de</strong>n gezien wordt als een waar<strong>de</strong>volle<br />
nieuwe analysetechniek voor met name hydrofiele<br />
componenten en zal naar verwacht<strong>in</strong>g <strong>in</strong> <strong>de</strong><br />
komen<strong>de</strong> <strong>de</strong>cennia een belangrijke plaats verwerven<br />
<strong>in</strong> <strong>de</strong> kl<strong>in</strong>isch-chemische praktijk.<br />
Reviews met overzichten van kl<strong>in</strong>isch-chemische en<br />
farmacologische applicaties zijn te v<strong>in</strong><strong>de</strong>n <strong>in</strong> <strong>de</strong> literatuur<br />
(14-17).<br />
Literatuur<br />
1. Reuss F von. Comment Soc Phys Univ Mosquensem<br />
1808; 1: 141.<br />
2. Everaerts FM, Beckers JL, Verheggen ThPEM. Isotachophoresis<br />
- Theory, Instrumentation and Applications. Elsevier,<br />
Amsterdam, 1976.<br />
3. Bocek P, Deml M, Gebauer P, Dolnik V. Analytical Isotachophoresis,<br />
VCH Verlagsgesellschaft mbH, We<strong>in</strong>heim,<br />
1988.<br />
218 Ned Tijdschr Kl<strong>in</strong> Chem 2000, vol. 25, no. 4
4. Grossman PD, Colburn JC (eds.). Capillary Electrophoresis:<br />
Theory and Practice, Aca<strong>de</strong>mic Press, San Diego,<br />
California, USA, 1992.<br />
5. V<strong>in</strong><strong>de</strong>vogel J, Sandra P. Introduction to Micellar Electrok<strong>in</strong>etic<br />
Chromatography. Hüthig Buch Verlag GmbH, Hei<strong>de</strong>lberg,<br />
1992.<br />
6. Li SFH. Capillary Electrophoresis, Pr<strong>in</strong>ciple, Practice and<br />
Applications. Elsevier, Amsterdam, 1992.<br />
7. Kuhn R, Hoffstetter-Kuhn S. Capillary Electrophoresis:<br />
Pr<strong>in</strong>ciples and Practice, Spr<strong>in</strong>ger Verlag, Berl<strong>in</strong>-Hei<strong>de</strong>lberg,<br />
1993.<br />
8. Foret F, Krivankova L, Bocek P. Capillary Zone Electrophoresis.<br />
VCH Verlagsgesellschaft mbH, We<strong>in</strong>heim, 1993.<br />
9. Altria KD. Quantitative Analysis of Pharmaceuticals by<br />
Capillary Electrophoresis. Vieweg Press, Weisba<strong>de</strong>n,<br />
1998.<br />
Ned Tijdschr Kl<strong>in</strong> Chem 2000; 25: 219-229<br />
Ned Tijdschr Kl<strong>in</strong> Chem 2000, vol. 25, no. 4<br />
10. CE and CEC Reviews. Ziad El Rassi (ed.). Electrophoresis<br />
1999; 20: No. 15-16.<br />
11. Atk<strong>in</strong>s PW. Physical Chemistry. Oxford University Press,<br />
Oxford, 1982.<br />
12. Ackermans MT, Everaerts FM, Beckers JL. J Chromatogr<br />
1991; 549: 345-355.<br />
13. Speciale editie over “Isotachoforese en stack<strong>in</strong>g techniques”<br />
van Electrophoresis.<br />
14. Thormann W et al. Electrophoresis 1994; 15: 3-12.<br />
15. Jellum EJ. Cap Elec 1994: 1: 97-105.<br />
16. Chen F-TA et al. Cl<strong>in</strong> Chem 1991; 37: 14-19.<br />
17. Lan<strong>de</strong>rs JP. Cl<strong>in</strong> Chem 1995; 41: 495-509.<br />
18. Kohlrausch F. Ann Phys (Leipzig) 1897; 62: 209-239.<br />
Capillary zone electrophoresis as a tool to <strong>de</strong>tect prote<strong>in</strong>s <strong>in</strong> body fluids: reproducibility,<br />
comparison with conventional methods and a review of the literature<br />
Capillary zone electrophoresis <strong>in</strong>volves the separation<br />
of charged molecules, e.g. prote<strong>in</strong>s, <strong>in</strong> a buffer-filled<br />
capillary tube by application of high voltage. CZE is a<br />
sensititive and rapid alternative for conventional gel<br />
electrophoresis techniques to separate prote<strong>in</strong>s <strong>in</strong><br />
body fluids. Serum, ur<strong>in</strong>e, cerebrosp<strong>in</strong>al fluid, synovial<br />
fluid and saliva analysis by CZE have been <strong>in</strong>vestigated<br />
<strong>in</strong> the past 10 years. CZE is a promis<strong>in</strong>g<br />
tool for rout<strong>in</strong>e cl<strong>in</strong>ical laboratories to automate<br />
serum prote<strong>in</strong> analysis. At present the separation and<br />
i<strong>de</strong>ntification of serum prote<strong>in</strong>s <strong>in</strong> or<strong>de</strong>r to <strong>de</strong>tect<br />
monoclonal gammopathies has been extensively studied.<br />
For this purpose, a complete automated system<br />
was evaluated (Paragon CZE 2000) and already <strong>in</strong>troduced<br />
<strong>in</strong>to rout<strong>in</strong>e cl<strong>in</strong>ical chemistry laboratories. In<br />
general, CZE shows comparable results to conventional<br />
methods for serum prote<strong>in</strong> screen<strong>in</strong>g and monoclonal<br />
component <strong>de</strong>tection and i<strong>de</strong>ntification.<br />
Applications for rout<strong>in</strong>e CZE analysis of ur<strong>in</strong>e or<br />
cerebrosp<strong>in</strong>al fluid analysis are still <strong>in</strong> <strong>de</strong>velopment<br />
and might be suitable to replace the conventional<br />
methods <strong>in</strong> the near future.<br />
Medical Laboratories, Re<strong>in</strong>ier <strong>de</strong> Graaf Group, Delft 1 ;<br />
Department of Cl<strong>in</strong>ical Chemistry, Aca<strong>de</strong>mic Hospital,<br />
Maastricht 2<br />
Correspon<strong>de</strong>nce to: Dr. ir. Y.M.C. Henskens, Laboratorium voor<br />
Algemene Kl<strong>in</strong>ische Chemie (LAKC), Aca<strong>de</strong>misch Medisch<br />
Centrum, F1-213, Postbus 22660, 1100 DD Amsterdam.<br />
E-mail: y.m.henskens@amc.uva.nl<br />
Y.M.C. HENSKENS 1 and M.P. van DIEIJEN-VISSER 2<br />
Key-words: capillary electrophoresis (CE); capillary<br />
zone electrophoresis (CZE); agarose gel electrophoresis<br />
(AGE); immunosubtraction capillary zone<br />
electrophoresis (CZE/IS); immunofixation electrophoresis<br />
(IFE); monoclonal component (MC)<br />
Capillary electrophoresis (CE) is an analytical tool<br />
for separat<strong>in</strong>g molecules based on molecular size,<br />
electric charge and hydrophobicity. Capillaries can be<br />
filled with a replaceable or fixed solid gel (capillary<br />
gel electrophoresis) or with a replaceable runn<strong>in</strong>g<br />
buffer (capillary zone electrophoresis). Capillary<br />
zone electrophoresis (CZE) has been suggested as a<br />
new tool for separation and quantification of serum<br />
prote<strong>in</strong>s (1-12). In addition, prote<strong>in</strong>s <strong>in</strong> other body<br />
fluids such as ur<strong>in</strong>e (13-19), cerebrosp<strong>in</strong>al fluid (15),<br />
synovial fluid (20, 21) and saliva (22) can also be <strong>de</strong>tected<br />
or quantified by CZE. CZE comb<strong>in</strong>es the separation<br />
pr<strong>in</strong>ciples of conventional electrophoresis with<br />
the advanced <strong>in</strong>strumental <strong>de</strong>sign of high-performance<br />
liquid chromatography and capillary technology.<br />
The sample is <strong>in</strong>troduced <strong>in</strong>to a buffer-filled<br />
fused silica capillary (<strong>in</strong>ternal diameter 20 to 200 µm<br />
and lengths of 10-100 cm), either electrok<strong>in</strong>etically<br />
or hydrodynamically with pressure. Figure 1 presents<br />
the specific requirements for (serum) prote<strong>in</strong> analysis<br />
as used by Wijnen and van Dieijen-Visser (11). Chang<strong>in</strong>g<br />
the <strong>in</strong>jection time can regulate the amount of sample<br />
applied. For separation, both ends of the capillary<br />
are placed <strong>in</strong>to a buffer solution that also conta<strong>in</strong>s the<br />
electro<strong>de</strong>s and high voltage is applied to the system.<br />
219