Lymfoproliferatieve aandoeningen - UZ Leuven
Lymfoproliferatieve aandoeningen - UZ Leuven
Lymfoproliferatieve aandoeningen - UZ Leuven
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
CAT:<br />
Flowcytometrische<br />
immunofenotypering op<br />
lymfeklierbiopsies/-aspiraten<br />
apr. Dries Coenen<br />
12 december 2006
Het lymfatisch systeem<br />
• = systeem van lymfevaten, lymfeklieren en extranodaal<br />
lymfatisch weefsel<br />
• lymfeklieren<br />
• = boonvormige orgaantjes (+/- 2 cm³) ) gelegen langs het<br />
verloop van de lymfevaten<br />
• filteren van de lymfe<br />
• opname van antigenen (bacteriën, virussen, …)) door<br />
macrofagen<br />
• macrofagen presenteren de antigenen aan lymfocyten =<br />
activatie van het immuunsysteem
Lymfeklieren
<strong>Lymfoproliferatieve</strong> <strong>aandoeningen</strong><br />
• = grote groep van neoplastische <strong>aandoeningen</strong> van het<br />
lymfatisch systeem (klonale(<br />
proliferatie van lymfoïde<br />
cellen)<br />
• lymfadenopathie = zwelling van een lymfeklier<br />
• oorzaken<br />
• meestal reactief (inflammatoire(<br />
reactie)<br />
• soms lymfoproliferatieve aandoening
<strong>Lymfoproliferatieve</strong> <strong>aandoeningen</strong><br />
• lymfoom = neoplastisch proces gelokaliseerd in de lymfeklieren<br />
of in extanodaal lymfatisch weefsel (vb. MALT)<br />
• lymfoom ↔ leukemie<br />
• dezelfde ziekte met verschillende klinische presentatie (SLL /<br />
B-CLL)<br />
• Hodgkin lymfomen ↔ non-Hodgkin Hodgkin lymfomen (NHL(<br />
NHL)<br />
• op basis van de aanwezigheid van Reed-Sternbergcellen
Classificatiesystemen<br />
• verleden:<br />
• Rappaport classification<br />
• Kiel classification<br />
• Working Formulation<br />
• REAL classification<br />
• heden:<br />
• WHO classification (2001)
WHO-classificatie<br />
van<br />
lymfoproliferatieve <strong>aandoeningen</strong><br />
• klinisch-pathologische<br />
entiteiten gedefinieerd op basis van:<br />
• kliniek<br />
• morfologie<br />
• immunofenotype<br />
• cytogenetische en moleculaire data<br />
→ multidisciplinaire aanpak vereist<br />
• classificatie<br />
• B-cell<br />
neoplasms<br />
• T- and NK-cell<br />
neoplasms<br />
• Hodgkin’s lymphoma
Proposed WHO<br />
Classification of<br />
Lymphoid Neoplasms<br />
(2001)
B-NHL<br />
• vallen onder de mature B-cell<br />
neoplasms<br />
• 85% van de NHL<br />
• meest voorkomende types zijn:<br />
diffuus grootcellig B-cel<br />
lymfoom 30.6%<br />
folliculair lymfoom 22.1%<br />
MALT lymfoom 7.6%<br />
CLL/SLL 6.7%<br />
mantelcellymfoom 6.0%
T-NHL<br />
• vallen onder mature T-cell<br />
neoplasms<br />
• 12% van de NHL<br />
• meest voorkomende types:<br />
perifeer T-cel<br />
lymfoom (niet gespecifieerd) 7.0%<br />
anaplastisch grootcellig lymfoom 2.4%<br />
• meer frequent in Azië (virus HTLV-1)
Lymfeklieronderzoek ikv<br />
lymfoproliferatieve <strong>aandoeningen</strong><br />
• staalname van een lymfeklier of extranodaal lymfatisch weefsel<br />
• via chirurgische biopsie<br />
• via punctie (vb. fijne naald aspiratie (FNA(<br />
FNA))<br />
• FNA versus chirurgische biopsie<br />
• voordeel: minder invasieve procedure<br />
• nadeel: verlies van weefselarchitectuur<br />
→ geen informatie over patroon van tumorgroei<br />
• onderzoeken<br />
• histologie / cytologie<br />
• immunofenotypering<br />
• cytogenetica / moleculaire diagnostiek
Wat is immunofenotypering?<br />
• = aantonen van expressie van cellulaire antigenen (CD(<br />
CD-antigenen)<br />
• hoe?<br />
• met behulp van monoklonale antilichamen gelabeld met een enzym of o<br />
fluorochroom<br />
• 2 technieken:<br />
• immunohistochemie (IHC)<br />
• simultane beoordeling celmorfologie en antigenexpressie met een<br />
lichtmicroscoop<br />
• uitgevoerd door de anatomopatholoog<br />
• flowcytometrische immunofenotypering (FCI)<br />
• meting van fluorescentie-intensiteit intensiteit op een celpopulatie met een<br />
flowcytometer
Immunofenotypering bij<br />
lymfoproliferatieve <strong>aandoeningen</strong><br />
• bepalen van de cellijn van een abnormale lymfoïde<br />
populatie (B of T)<br />
• CD19 - CD20 - CD22 → B-cel<br />
• CD2 - CD3 - CD5 - CD7 → T-cel<br />
• aantonen van monoklonaliteit<br />
• B-cel: IgKappa of IgLambda lichte ketenrestrictie<br />
• T-cel: overexpressie van bepaalde V-beta<br />
familie<br />
• bepalen of monoklonale celpopulatie een specifiek immunofenotype heeft<br />
geassocieerd met een bepaald type lymfoproliferatieve aandoening<br />
(classificatie)
Principe FCI<br />
• incubatie met monoklonale antilichamen gelabeld met een fluorochroom<br />
• cel per cel hydrodynamisch gefocusseerd doorheen één n of meer laserstralen<br />
• meten van lichtverstrooiing en fluorescentie-intensiteit intensiteit per cel<br />
• forward scatter ~ celgrootte<br />
• side scatter ~ granulariteit<br />
• fluorescentieintensiteit ~ antigenexpressie<br />
• meerdere antigenen aantoonbaar per cel<br />
• gebruik van verschillende antilichamen met verschillende fluorochromen<br />
met andere fluorescentie-emissie emissie golflengte<br />
• cellen weergegeven als puntenwolk in histogrammen
Principe FCI<br />
• celdifferentiatie op basis van ligging op:<br />
CD45-SCC histogram SCC-FSC<br />
histogram<br />
R1<br />
R2<br />
R3<br />
R4<br />
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4<br />
SSC-Height<br />
0 200 400 600 800 1000<br />
FSC-Height<br />
• ‘gating’ van relevante celcluster en onderzoeken op expressie van<br />
antigenen
Flowcytometrie in LAG<br />
• 4-kleuren<br />
flowcytometrie<br />
• in het kader van diagnose/classificatie/MRD van een<br />
lymfoproliferatieve aandoening uitgevoerd op:<br />
• perifeer bloed<br />
• beenmergaspiraat<br />
• niet op lymfeklierweefsel
Critically Appraised Topic<br />
• Wat is de waarde van FCI op lymfeklierweefsel<br />
bij de diagnose en classificatie van lymfomen<br />
volgens de literatuur?<br />
• Wat zijn de voordelen/nadelen van FCI in<br />
vergelijking met IHC?
Vereisten voor flowcytometrie op<br />
lymfeklierweefsel<br />
• suspensie van afzonderlijke intacte cellen<br />
• celsuspensie<br />
• perifeer bloed / beenmergaspiraat / FNA<br />
• reeds celsuspensies<br />
• lymfeklierweefsel bekomen via chirurgische biopsie<br />
• eerst celsuspensie bereiden door mechanische of enzymatische<br />
desaggregatie en filtratie<br />
• intacte cellen<br />
• vers staal binnen < 24h analyseren
Referentiewaarden in lymfeklieren<br />
• omwille van ethische redenen weinig gegevens beschikbaar<br />
• primaire follikels → secundaire follikels oiv antigenstimulus<br />
• B-lymfocyten<br />
in het germinaal centrum van secundaire follikels<br />
→ exprimeren zwak CD10<br />
• B-lymfocyten<br />
in mantelzone (1/3) van de follikel → exprimeren<br />
CD5
Lymfeklier
Referentiewaarden in lymfeklieren<br />
• Bagglatia et al.<br />
• vergelijking lymfocytenpopulaties in lymfeklieren en perifeer<br />
bloed bij 22 patiënten<br />
(4 patiënten met een goedaardige aandoening en 18 vrouwen<br />
met gynaecologische tumor in vroeg stadium)<br />
T-cellen<br />
B-cellen<br />
NK-cellen
Analytische performantie van FCI<br />
• geen gegevens beschikbaar voor FCI op lymfeklierweefsel<br />
• analytische sensitiviteit<br />
• Sánchez<br />
et al.<br />
• studie op PB en BM stalen met 4-kleuren 4<br />
flowcytometer<br />
• 1 aberrante cel op 10 4 à 10 5 cellen
Diagnostische performantie<br />
van FCI op lymfeklierbiopsies<br />
• 3 grotere relevante studies<br />
• Ravoet C, Demartin S, Gerard R, Dehon M, Peny MO, Petit B, Delannoy A,<br />
Husson B. Contribution of flow cytometry to the diagnosis of malignant<br />
and non malignant conditions in lymph node biopsies. Leuk<br />
Lymphoma. . 2004 Aug;45(8):1587<br />
;45(8):1587-93.<br />
• Martinez A, Aymerich M, Castillo M, Colomer D, Bellosillo B, Campo E,<br />
Villamor N. Routine use of immunophenotype by flow cytometry in<br />
tissues with suspected hematological malignancies. Cytometry B Clin<br />
Cytom. . 2003 Nov;56(1):8<br />
;56(1):8-15. 15.<br />
• Dunphy CH. Contribution of flow cytometric immunophenotyping to<br />
the evaluation of tissues with suspected lymphoma? Cytometry. . 2000<br />
Oct 15;42(5):296-306.
Ravoet et al.<br />
• Hospital of Jolimont, Haine-Saint<br />
Saint-Paul, Belgium<br />
• retrospectieve studie van 118 consecutieve lymfeklierbiopsies<br />
• 4-kleuren<br />
FCI<br />
• 116 geschikte stalen<br />
• panels voor detectie van B-, B , T-, T RS-, , en epitheliale cellen
Ravoet et al.
Ravoet et al.<br />
• overeenkomst FCI – histologie in 88% (102/116)<br />
• classificatie B-NHL<br />
• 77% (23/30) correct geclassificeerd<br />
• Hodgkin lymfoom<br />
• diagnose op basis van aanwezigheid van cellen met Reed-Sternberg<br />
fenotype (CD45-/CD15+/CD30+)<br />
• 6/15 diagnose zeer waarschijnlijk (> 1 op 10 4 cellen)<br />
• 6/15 diagnose waarschijnlijk (> 1 op 10 5 cellen)<br />
• echter niet specifiek criterium
Martinez et al.<br />
• Hospital Clinic, University of Barcelona, , Spain<br />
• 422 consecutieve biopsies<br />
• 3-kleuren FCI<br />
• 377 geschikte stalen
Martinez et al.<br />
• voor NHL<br />
• sensitiviteit = 90%<br />
• specificiteit = 100%<br />
• ppv = 79%<br />
• npv = 100%<br />
• voor Hodgkin lymfoom<br />
• sensitiviteit = 0%<br />
• goede overeenkomst<br />
morfologie/IHC en FCI<br />
behalve voor Hodgkin<br />
lymfomen
Martinez et al.<br />
• Ig-lichte<br />
ketenexpressie analyse<br />
• 91 gevallen zowel IHC als FCI<br />
• interpretatie mogelijk<br />
• IHC: : 42% (38/91)<br />
• FCI: : 100% (91/91)<br />
• wel goede overeenkomst tussen IHC en FCI
Martinez et al.<br />
• classificatie B-NHL<br />
• CLL en MCL:<br />
• FL:<br />
goed<br />
matig
Dunphy<br />
• St. Louis University Health Sciences Center, Missouri, , USA<br />
• retrospectieve studie van 373 biopsiestalen met data van<br />
histologie/IHC en 2-kleuren 2<br />
FCI
Dunphy<br />
# histology/IHC<br />
FCI<br />
161<br />
B-cell<br />
lymphoma<br />
monoclonal or aberrant B-cell<br />
population<br />
198 =<br />
16<br />
T-cell<br />
lymphoma<br />
aberrant or common thymocytic T-<br />
cell population<br />
21<br />
B-/T-NHL<br />
negative for lymphoma<br />
26<br />
Hodgkin lymphoma<br />
negative for lymphoma<br />
128<br />
benign<br />
negative for lymphoma<br />
13<br />
nonhematopoietic malignancy<br />
negative for lymphoma<br />
4<br />
nonlymphomatous hematopoietic<br />
malignancy<br />
negative for lymphoma and<br />
nonlymphomatous hematopoietic<br />
malignancy by other flow markers<br />
2<br />
composite lymphoma or composite<br />
malignancy<br />
aberrant T-cell<br />
or monoclonal B-<br />
cell population<br />
2<br />
posttransplantation<br />
lymphoproliferative disorder<br />
negative
Dunphy<br />
• voor NHL<br />
• sensitiviteit = 89%<br />
• specificiteit = 100%<br />
• voor Hodgkin lymfoom<br />
• sensitiviteit = 0%
Diagnostische performantie<br />
van FCI op fijne naald aspiraten<br />
• talrijke studies onderzochten de bijdrage van FCI voor de<br />
diagnose en classificatie van lymfomen op fijne naald aspiraten<br />
• combinatie cytologie/FCI op FNA meestal vergeleken met<br />
histologie<br />
• meeste studies concentreren zich op mogelijkheid van FCI<br />
om NHL te diagnosticeren en te classificeren<br />
• diagnose van NHL in +/- 75-95% mogelijk met combinatie<br />
cytologie/FCI<br />
• classificatie in +/- 70-80% van de positieve gevallen mogelijk
Oorzaken van vals negatieve FCI<br />
• sampling error: : onvoldoende of niet representatieve staalname<br />
• partiële<br />
lymfoominvasie<br />
• weefselsclerose<br />
• fragiliteit van sommige lymfoomcellen<br />
• afwezigheid van sIgκ of sIgλ<br />
• geen CD45 expressie<br />
• lage aantallen maligne cellen op een reactieve achtergrond
FCI en diffuus grootcellige B-cel<br />
lymfomen<br />
• 30% van de NHL<br />
• heterogene groep zonder specifiek immunofenotype<br />
• vaker vals negatieve FCI (+/- 25%)<br />
• vaker weefselsclerose<br />
• fragiele natuur van deze lymfoomcellen<br />
• vaker afwezigheid van Ig-lichte<br />
ketenrestrictie
FCI en Hodgkin lymfomen<br />
• 15% van alle lymfomen<br />
• Reed-Sternbergcellen<br />
• omgeven door vele inflammatoire lymfocyten (CD4/CD8-<br />
verhouding ↑, , echter weinig specifiek)<br />
• fragiele natuur<br />
• fibreus weefsel → moeilijke cellulaire dispersie<br />
• geen consensus over antigenprofiel (CD15+/CD30+?)<br />
→ detecteren/diagnosticeren van een Hodgkin lymfoom is<br />
onmogelijk met FCI
Besluit diagnostische performantie<br />
• indien monoklonale populatie aantoonbaar met FCI →<br />
lymfoproliferatieve aandoening aanwezig<br />
• indien negatief FCI resultaat → maligniteit kan niet uitgesloten<br />
worden<br />
• histologie/cytologie blijft zeker nodig!
Voordelen FCI tov IHC<br />
• simultane detectie van meerdere antigenen (meerkleuren FCI)<br />
• kortere TAT (analyseduur 3 uur, elke weekdag)<br />
• kwantitatieve resultaten waardoor interpretatie minder subjectief<br />
• detectie van lagere aantallen maligne cellen<br />
• uitgebreider aanbod monoclonale antilichamen<br />
• superieur voor aantonen sIgκ/sIg<br />
sIgλ<br />
• mogelijk op kleinere hoeveelheid staal
Nadelen FCI tov IHC<br />
• geen visuele correlatie tussen morfologie en antigenexpressie<br />
• verlies van patroon van tumorgroei ingeval van biopsiemateriaal<br />
• vers staal nodig
Diagnostische impact<br />
• WHO-diagnose<br />
nooit gesteld op basis van één n type diagnostisch onderzoek<br />
• integratie van deeldiagnoses tot een volledige diagnose (multidisciplinaire<br />
aanpak)<br />
• Aantonen van monoclonale populatie met FCI kan belangrijk argument zijn<br />
in de diagnosestelling<br />
• Indien definitieve diagnose reeds mogelijk met histologisch onderzoek is FCI<br />
slechts van beperkte waarde
Therapeutische impact<br />
• Wat is de impact op behandeling?<br />
• FCI kan bijdragen in diagnosestelling en classificatie en zo<br />
therapie initiëren<br />
• therapiekeuze afhankelijk van type lymfoom en stadium<br />
• Kan behandeling optimaler toegediend worden?<br />
• FCI bruikbaar voor aantonen targetantigen van sommige<br />
therapieën n (CD20 – rituximab)
Health outcome<br />
• indien definitieve diagnose mogelijk op een FNA kunnen meer<br />
invasieve investigaties vermeden worden<br />
• vooral interessant ingeval van recidief
Werd test opgenomen in guidelines?<br />
• British Committee for Standards in Haematology (BCSH)<br />
guideline “Diagnosis and therapy for nodal non-Hodgkin<br />
Hodgkin’s<br />
lymphoma” (2002)<br />
• eerst PB (cytologie en FCI) ) om CLL of ALL uit te sluiten<br />
• lymfeklierweefsel via excisiebiopsie, , FNA afgeraden<br />
• immunofenotypering met flowcytometrie of immunohistochemie<br />
• US-Canadian<br />
Canadian Consensus Recommendations on<br />
immunophenotypic analysis (1997)<br />
• immunofenotypering op lymfeklierbiopsies met FCI of IHC<br />
• FCI superieur omwille van lagere detectielimiet, objectiviteit en snelheid<br />
• FCI niet geschikt voor Hodgkin lymfomen<br />
• FNA afgeraden
Kost impact<br />
• Reële productiekost<br />
• consumables = 10.18 € x aantal gebruikte antilichamen<br />
• task unit & labor = 6.14 €<br />
• overhead = 1.77 €<br />
• totale kost per FCI met 10 antilichamen = 109.71 €<br />
• RIZIV-nomenclatuur<br />
• klinische biologie<br />
• nummer 555730-555741(B500) 555741(B500) en nummer 556474-556485 556485 (B400)<br />
voor identificatie van antigenen (max. 13) van hematopoïetische<br />
etische<br />
cellen in bloed<br />
• APO<br />
• nummer 588070-588081 588081 voor immunohistochemische onderzoeken<br />
(max.4) voor het aantonen van antigenen in coupes<br />
• geen RIZIV-nomenclatuur<br />
voor FCI op lymfeklierweefsel
Decision making<br />
• impact van de FCI op lymfeklierweefsel op het beslissingsproces<br />
van de clinicus en patiëntenmanagement?<br />
• aantonen van monoclonale populatie in lymfeklier kan<br />
doorslaggevend argument vormen in de definitieve diagnose
Is er voldoende interesse vanuit de<br />
kliniek?<br />
• prof. G. Verhoef en dr. A. Janssens (hematologen) hebben<br />
interesse<br />
• FNA als ‘eerste<br />
screening’ bij een nieuwe patiënt (niet voor<br />
definitieve diagnosestelling)<br />
• in geval van recidief kan FNA wel<br />
• prof. C. Peeters (anatomopatholoog(<br />
anatomopatholoog) ) is bereid om ons een deel<br />
van de lymfeklier ter beschikking te stellen indien voldoende<br />
materiaal
Wat doen andere centra?<br />
• AZ Sint-Jan<br />
Brugge<br />
• OLV Aalst<br />
• Virga Jesse Hasselt<br />
• <strong>UZ</strong> Gent<br />
• Erasmus Rotterdam<br />
voeren FCI uit op lymfeklierweefsel
FCI op lymfeklierweefsel invoeren?<br />
• argumenten pro<br />
• de voordelen van FCI tov IHC<br />
• combinatie van verschillende testen kan leiden tot betere diagnostische<br />
accuraatheid: FCI op lymfeklierweefsel als bijkomend argument<br />
• argumenten contra<br />
• de nadelen van FCI tov IHC<br />
• relatief veel vals negatieve FCI<br />
• geen RIZIV-terugbetaling<br />
voor FCI op klierweefsel<br />
• mogelijk lage testfrequentie<br />
• FNA geen algemeen aanvaarde diagnostische techniek
To Do / Actions<br />
• Al dan niet invoeren van FCI op lymfeklierweefsel (FNA en/of<br />
biopsie) ) in overleg met hematologen / anatomopathologen<br />
• Indien we beslissen de test in te voeren<br />
• valideren van de analyse<br />
• opstellen van een SOP<br />
• aanvragen RIZIV terugbetaling<br />
• organiseren overleg tussen hematologen / klinisch biologen /<br />
anatomopathologen om elkaars bevindingen met elkaar te<br />
correleren
Change language