Effecten van kalium-ionen in de bestrijding van Biofilms, Amoeben ...

50452040-KPS/MEC 04-7143
Effecten van kalium-ionen in de
bestrijding van Biofilms, Amoeben en
Legionella
Arnhem, 26 Oktober 2004
Auteurs: M.C.M. Bruijs*, L.P. Venhuis*, H. van Houten**
* KEMA Power Generation & Sustainables
** Iv-Water b.v.
In opdracht van Corus Staal BV, Oxystaalfabriek 2
Gecoördineerd door Corus Staal BV, Environmental Management
auteur : Bruijs beoordeeld : Jenner
B 47 blz. 2 bijl. goedgekeurd : Zeijseink
Utrechtseweg 310, 6812 AR Arnhem.
Telefoon (026) 3 56 91 11. Telefax (026) 3 51 56 06.

© KEMA Nederland B.V., Arnhem, Nederland. Alle rechten voorbehouden.
Dit document bevat vertrouwelijke informatie. Overdracht van de informatie aan derden zonder schriftelijke toestemming
van of namens KEMA Nederland B.V. is verboden. Hetzelfde geldt voor het kopiëren van het document of een gedeelte
daarvan.
KEMA Nederland B.V. en/of de met haar gelieerde maatschappijen zijn niet aansprakelijk voor enige directe, indirecte,
bijkomstige of gevolgschade ontstaan door of bij het gebruik van de informatie of gegevens uit dit document, of door de
onmogelijkheid die informatie of gegevens te gebruiken.

-3- 50452040-KPS/MEC 04-7143
INHOUD
blz.
SAMENVATTING .....................................................................................................................5
VERKLARENDE WOORDENLIJST .........................................................................................8
1 Inleiding ..................................................................................................................9
1.1 Achtergrond ............................................................................................................9
1.2 Aanleiding project .................................................................................................11
1.3 Doel ......................................................................................................................12
2 Experimentele opzet .............................................................................................13
2.1 Uitvoering experimenten.......................................................................................13
2.2 Mobiel laboratorium ..............................................................................................14
2.2.1 TestRig .................................................................................................................15
2.3 Microbiologische monitoring en analyse...............................................................19
2.3.1 Biofilm monitoring .................................................................................................19
2.3.2 ATP.......................................................................................................................19
2.3.3 Legionella .............................................................................................................20
2.3.4 Amoeben ..............................................................................................................20
2.4 Uitvoering experimenten:......................................................................................20
2.4.1 Test 1: Dosering 3 gr/l Kaliumchloride..................................................................20
2.4.2 Test 2: Dosering 17,5 gr/l Kaliumdiwaterstoffosfaat .............................................21
2.4.3 Test 3: Dosering 17,5 gr/l Kaliumdiwaterstoffosfaat met surfactant .....................22
3 Resultaten.............................................................................................................24
3.1 Biofilm monitoring, ATP- en Legionella-bepalingen..............................................24
3.1.1 Resultaten test 1: Dosering Kaliumchloride..........................................................24
3.1.2 Resultaten test 2: Dosering Kaliumdiwaterstoffosfaat ..........................................25
3.1.3 Resultaten test 3: Dosering Kaliumdiwaterstoffosfaat met surfactant ..................27
3.2 Determinatie amoeben en overige protozoa in koelwater van de OSF2 ..............29
3.3 Bepaling van amoeben en andere protozoa in het TestRig..................................29
4 Discussie en conclusies........................................................................................33
5 Aanbevelingen......................................................................................................36
LITERATUUR.........................................................................................................................37

-4- 50452040-KPS/MEC 04-7143
Bijlage A BioGeorge .........................................................................................................40
5.1 Principe.................................................................................................................40
5.2 Sensor ..................................................................................................................40
5.2.1 ‘Cilindrische’ sensor..............................................................................................40
5.3 Werking.................................................................................................................41
5.4 Controller ..............................................................................................................42
5.5 Outputdata............................................................................................................43
5.6 Detectie van microbiële verslijming ......................................................................44
Bijlage B Enzymatische bepaling van microbiële activiteit...................................................45

-5- 50452040-KPS/MEC 04-7143
SAMENVATTING
De huidige technologieën voor koelwaterbehandeling die in de meeste bedrijven ingezet
worden, geven vaak problemen met Legionella die terug te voeren zijn op een aantal
specifieke factoren. Zo is er vaak een hoger ijzergehalte (bevordert de groei van Legionella)
en is er de aanwezigheid van gastheercellen, met name protozoa (de groei van Legionella
vindt plaats in protozoa, met name amoeben; die eveneens zorgt voor bescherming tegen
biociden). Bestrijding van amoeben met oxidatieve biociden zoals chloor is moeilijk omdat
relatief hoge concentraties aan “Free Oxidant” (vrij beschikbaar chloor) nodig zijn. De
amoeben leven in biofilms waar het werkzame chloor moeilijk in doordringt. Als laatste is de
lozing van vrij halogeen (chlorerings-bijproduct) lozingstechnisch aan strikte limieten
gebonden en kunnen hoge chloorconcentraties corrosie veroorzaken aan diverse materialen
in een koelwatersysteem.
De duurzame technologie die onderzocht wordt is de groei van Legionella te voorkomen door
de bestrijding van amoeben en de biofilm. Dit is mogelijk door de biocoenose, de microleefgemeenschap
zoals deze groeit en samenleeft in een biofilm, enkele uren of dagen bloot
te stellen aan totaal andere fysisch-chemische omstandigheden. De te testen methode
beoogt in te grijpen in de fysiologie van deze levensgemeenschap door kortdurende
toevoeging van kalium-ionen (enkele uren deze concentratie te verhogen) eventueel in
combinatie met een surfactant voor een betere indringing in de biofilm. Eerdere
toepassingen van deze techniek zijn niet bekend. Door KEMA en Iv-Water zijn reeds
labproeven met rivierwater (De Rijn) uitgevoerd, deze experimenten hebben zeer positieve
resultaten opgeleverd. Het effect op de natuurlijke biofilm aangroei is op glasplaatjes
(microscoop slides) visueel getest bij verschillende kalium-concentraties. Dit liet een snelle
inactivatie zien van de in de biofilm aanwezige protozoa, alsook afbraak van de biofilm.
Vervolgens werd in het mobiele laboratorium met rivierwater (De Rijn) in een
doorstroomsysteem met behulp van een biofilm activiteit monitor, genaamd BioGeorge de
microbiologische activiteit van de biofilm on-line gevolgd in de tijd. Bij een oplopend kaliumzoutgehalte
tot 2,5 gr/l was een snelle afname in activiteit waar te nemen. Deze afname ging
sneller dan werd verwacht. De aantallen protozoa in een biofilm zijn lager dan de aantallen
bacteriën, de afname in activiteit van de bacteriën is echter waarschijnlijk evenredig met de
afname in activiteit van protozoa. Verhoging van het kalium-concentratie, veroorzaakt tevens
een toename in de pinocytose-activiteit (= afsnoeren van blaasje in het cytoplasma) van
amoeben waardoor deze te gronde kunnen gaan.
Doel van dit project is de microbiologische aangroei (biofilm) in het algemeen en de groei
van amoeben en Legionella in het bijzonder te bestrijden door een fysiologische bestrijding

-6- 50452040-KPS/MEC 04-7143
met de toevoeging van een kalium-verbinding. Hierbij is nagegaan of de biofilm en de
protozoa kunnen worden bestreden door ze bloot te stellen aan een verhoogde kaliumconcentratie,
volgens de labproeven op KEMA minder dan 12 uur, waardoor de
gastheerfunctie van amoeben wegvalt voor het vermenigvuldigen van de Legionella-bacterie.
Getest is of de in de waterfase aanwezige Legionella-bacteriën eveneens ten gronde gaan,
dit lijkt zeer waarschijnlijk gezien het effect van een electrolyt-verbinding op bacteriën.
De te bereiken milieuverdienste is een vermindering van het chloorbleekloog-verbruik, en
daarmee ook van de lozing van vrij halogeen. Om een kwantitatieve schatting van deze
vermindering te geven zijn op dit moment onvoldoende gegevens beschikbaar.
Een grootschalige proef is opgezet bij Corus Strip Products te IJmuiden om te onderzoeken
of het periodiek doseren van een kalium-verbinding, al of niet in combinatie met een
surfactant, een oplossing is ter bestrijding van Legionella in het koelwatersysteem van de
Continu Gietmachine van Oxystaalfabriek 2 (OSF2). Hiervoor is het mobiele KEMAlaboratorium
bij OSF2 opgesteld. In het TestRig van het mobiele lab kan het circulatiewater
(zelfde watersamenstelling) van de gietmachine gebruikt worden om een identieke biofilm te
ontwikkelen op de probes van de BioGeorge en op microscoopglaasjes. Deze zijn daarna
getest door de kalium-verbinding bij verschillende concentraties toe te voegen aan het
recirculerende water. Met de slides zijn de fysiologische effecten op protozoa met
microscopie vastgelegd. Daarnaast is de onderdrukking van het aantal Legionella-bacteriën
getest via de geëigende uitplaat-technieken.
Het TestRig is een klein recirculatiesysteem voorzien van een koeltoren. In dit systeem is
biofilm opgebouwd en daarna blootgesteld aan volgens de literatuur en KEMA-onderzoek
effectieve kalium-concentraties van 0,04 en 0,128 mol/l. Het effect van deze kalium-dosering
op de biofilm is on-line geregistreerd met behulp van een biofilm activiteitsmonitor en
enzymbepalingen op basis van ATP. Bovendien zijn voor en na dosering Legionellamonsters
genomen.
Uit de resultaten van de diverse experimenten kan worden geconcludeerd dat ondanks de in
studies beschreven vermeende gevoeligheid voor kalium-ionen van amoeben en biofilm, en
aanvullend KEMA-onderzoek uitgevoerd in zoetwater, er bij de dosering van een
kaliumverbinding in het koelwatersysteem van OSF2 van Corus Strip Products te IJmuiden,
geen significante afname in biofilm-activiteit en Legionella–concentraties is waargenomen.
Ook de toepassing van een surfactant voor het ‘weekmaken’ van de biofilm, waardoor het
indringend vermogen van de kalium-ionen in de biofilm wordt geacht te worden gestimuleerd,
heeft niet geleid tot een significante afname in biofilm-activiteit.

-7- 50452040-KPS/MEC 04-7143
Waarschijnlijk is de compositie van de gevormde xPS (xPS is de slijmlaag waarin de
bacteriën en protozoa leven) in de ontwikkelde biofilm in het brakke met o.a. vet en olie
vervuilde koelwater van OSF2 bij Corus Strip Products zo aangepast aan dit milieu, dat de
biofilm en de aanwezige Legionella-bacterien een bepaalde mate van zout-tolerantie hebben
opgebouwd. Dit zou resulteren in de noodzaak van aanzienlijk hogere kalium-concentraties
ter bestrijding van de aanwezige biofilm en Legionella. Ook is het mogelijk dat door de
verontreinigingen in het koelwater de biofilm een zeer ondoordringbare xPS heeft gevormd
zodat de kalium-ionen ondanks toevoeging van een surfactant niet kunnen binnendringen in
de biofilm. Doseringen van nog hogere kalium-concentraties in koelwatersystemen wordt
doorgaans door de hoge salaniteitstoename in het koelwater van OSF2 praktisch gezien als
niet verantwoord geacht. Ter bestrijding van Legionella en biofilms in het algemeen in het
koelwater van OSF2 is het in dit geval beter over te gaan op een andere oxidatieve of nonoxidatieve
biocide.
Aanbevolen wordt om de huidige chloorbleekloog-dosering van OSF2 bij Corus Strip
Products te evalueren op de effectiviteit van biofilm bestrijding en op de mogelijkheid van
toepassing van een andere biocide. Voor een goede hygiëne van het koelwatersysteem
blijven adequaat technisch onderhoud en een goede waterbehandeling belangrijk voor de
preventie van Legionella-besmetting.

-8- 50452040-KPS/MEC 04-7143
VERKLARENDE WOORDENLIJST
Aëroob Milieu waarin een bepaalde concentratie aan zuurstof aanwezig is
Anaëroob Milieu dat zuurstofloos is
ATP
Adenosine-5’-trifosfaat (ATP) is een energierijke verbinding die onder
andere voorkomt in micro-organismen
xPS
Extra Cellulair Polymeric Substances zijn koolwaterstoffen (voornamelijk
poly-sacchariden) die door micro-organismen worden uitgescheiden tijdens
de overgang van vrije(planktonische) fase naar immobiele vastzittende fase
(biofilm)
KVE
Kolonie vormende eenheden (KVE), in engels CFU, is een maat voor de
detectie van levende micro-organismen. De aanwezige levende microorganismen
zullen zich op een voedingsbodem vermenigvuldigen en
kolonies vormen die waarneembaar zijn voor het menselijk oog
Legionellose Infectie met de bacterie Legionella pneumophila, veroorzaker van de
‘veteranenziekte’
Lyseren (lysis) Degeneratie: de dood en daarop volgende afbraak van een cel.
MIC
Microbial Influenced Corrosion (Microbiologische Geïnduceerde Corrosie),
is een proces waarbij micro-organismen een bacteriesoort specifiek
corrosief milieu creëren waarin corrosieprocessen aanzienlijk worden
versneld
RLU
Relative Light Units (Relatieve lichteenheden) is een maat voor een
hoeveelheid uitgezonden licht, deze lichthoeveelheid heeft een vaste
verhouding met de hoeveelheid ATP in het monster (1 picogram ATP/ml =
7.2 RLU)
SRB Sulfaatreducerende bacteriën (SRB’s) zijn anaërobe bacteriën die
sulfaationen-reduceren tot sulfide-ionen. Deze sulfide-ionen kunnen een
verbinding aangaan met metaal-ionen, waardoor de corrosiesnelheid van
het metaal aanzienlijk wordt versneld

-9- 50452040-KPS/MEC 04-7143
1 INLEIDING
1.1 Achtergrond
Wanneer metalen oppervlakten, zoals de pijpen van een warmtewisselaar, in aanraking
komen met oppervlaktewater worden deze direct geconditioneerd door adsorptie van
organisch materiaal en gekoloniseerd door bacteriën. De bacteriën die aanwezig zijn in
oppervlakte(koel)water migreren naar de metalen oppervlakte en hechten zich hieraan
binnen enkele uren door afzetting van Extracellulaire Polymeren Substanties (xPS). De
polymeren vormen een gel-achtige matrix waarin de bacteriën worden ingesloten, de
zogenaamde biofilm (Wingender et al., 1999). De polymeren waaruit de xPS bestaat, zijn
hoofdzakelijk eiwitten en suikers.
Vermenigvuldiging van bacteriën in een biofilm en het invangen van organisch materiaal en
andere micro-organismen uit de waterfase leidt tot een toename en versnelling van de
biofilmopbouw. De altijd aanwezige micro-organismen in oppervlaktewater tolereren een
breed scala aan omgevingscondities zoals temperatuur en zuurgraad (pH). Microorganismen
kunnen condities, die bevorderlijk zijn voor hun levensprocessen, waarnemen en
zijn mobiel. Dit heeft tot gevolg dat micro-organismen ‘levende aantastingen’ vormen op
oppervlakken. Het vormen van een biofilm is voor micro-organismen de favoriete vorm van
voortbestaan, dat deel uitmaakt van hun strategie tot overleven (Marshall, 1996).
Het plakkerige xPS in de biofilm biedt bescherming aan de micro-organismen in de biofilm en
vormt op deze wijze een afgesloten milieu waardoor resistentie ontstaat voor fysischchemische
omstandigheden vanuit de waterfase, zoals de inwerking van biociden (Brown
and Gilbert, 1993; Morton et al., 1998). Hoewel sommige biociden zeer effectief zijn in het
afbreken van een xPS-matrix, moeten concentraties vaak 10 tot 100x verhoogd worden om
dezelfde effectiviteit in de bestrijding van biofilms te verkrijgen vergeleken met bacteriën in
de waterfase (Holah,1992). Bestrijding van biofilms wordt steeds moeilijker naarmate de
biofilm zich verder ontwikkeld. Studies van Wolfaardt et al. (1995;1998) tonen aan dat het
milieu waaraan de biofilm wordt blootgesteld van invloed is op de vorming (hoeveelheid en
dikte) en compositie van de gevormde xPS. Waardoor het milieu een belangrijke invloed
heeft op de gevormde xPS-matrix en de doorlaatbaarheid van een biofilm.
Doordat er een afgesloten milieu in een biofilm ontstaat kan de biofilm werken als een
diffusie barrière, waardoor er een zuurstofgradiënt ontstaat. De zuurstof die zich bevindt aan
de buitenzijde van de biofilm wordt verbruikt. Hierdoor ontstaan anaërobe zones waarin
specifieke anaërobe micro-organismen zich kunnen ontwikkelen. Voorbeeld hiervan zijn

-10- 50452040-KPS/MEC 04-7143
sulfaatreducerende bacteriën (SRB), die aanzienlijke putcorrosie aan metalen oppervlakken
veroorzaken. Doordat er zoveel specifieke milieus gecreëerd kunnen worden in een biofilm,
kunnen ze ook fungeren als een voedingsbodem voor pathogene (= ziekteverwekkende)
micro-organismen (Billot-Bonef et al., 2001). Deze pathogenen kunnen dan uitreden vanuit
de biofilm en de waterfase besmetten. Voornamelijk in (open) recirculatiesystemen kan
hierdoor de activiteit van pathogene micro-organismen dusdanig toenemen, dat het gevaar
kan opleveren voor werknemers en directe omwonenden. Deze activiteit-toename kan nog
worden bevorderd door een relatief hoge watertemperatuur, en het aanwezig zijn van
voldoende zuurstof- of nutriënten-aanvoer.
Humane pathogene micro-organismen die vaak in verband worden gebracht met koeltorens
zijn de amoeben Neagleria spp. en Acanthamoebe spp. en de bacterie Legionella
pneumophila die de bekende ‘veteranenziekte’ veroorzaakt. De aanwezigheid van biofilms in
koelwatersystemen heeft duidelijk invloed op de Legionella-concentratie in de waterfase.
Door menging tussen biofilm en recirculerend water wordt de concentratie Legionella in de
waterfase verhoogd (Howland et al., 1983). Legionella kan zich in een eencellige gastheer
vermenigvuldigen (Rowbotham, 1980; Babaree, 1986; Kwaik et al., 1998). Hiervoor leeft
deze bacterie in associatie met protozoa, voornamelijk amoeben. Deze amoeben spelen
tevens bij de biocoenose op en in een biofilm een belangrijke rol. Protozoa en metazoa
grazen op de biofilm en graven zich in waardoor waterkanalen en waterbellen in een biofilm
ontstaan (Jackson & Jones, 1991). Hierdoor is een biofilm continu onderhevig aan
veranderingen.
De voedingsstrategieën van vrijlevende amoeben zijn complex, hoewel de meeste
heterotrofe/mixotrofe soorten zich voeden met bacteriën die langzaam worden omcirkeld met
behulp van zijn pseudopodia. De pseudopodia worden gevormd door uitbreidingen van de
celmembraan en het cytoplasma (celvocht). Het voedsel wordt volledig ingesloten door
celmembraan, en wordt opgenomen in de cel. Binnen deze membraan kunnen de
metabolische processen reeds starten. Opgeloste materialen kunnen de cel binnenkomen
door een analoog proces: dit "drinkproces" wordt "pinocytose" genoemd. Water daarentegen
kan op alle plaatsen door de celmembraan diffunderen. Opgeloste gassen, zoals zuurstof
voor de ademhaling, dringen door de membraan zoals bij het pinocytose-proces.
Waarnemingen aan Amoeba proteus hebben laten zien dat in het geval van continue
pinocitose, er kanalen worden gevormd die ontstaan aan de toppen van de gespecialiseerde
pinocytotische pseudopodia, die radicaal uitgroeien. Deze vorm van de amoebe heet een
pinocytotische rozet en wordt geïnduceerd door Na + en K + -ionen. In dit stadia is de amoebe
inactief en verliest het zijn voortbewegingsactiviteit. Deze pinocytotische-rozet-fase treedt bij
Amoeba proteus op na 12 minuten blootstelling aan een 0,125 mol/l NaCl-oplossing in

-11- 50452040-KPS/MEC 04-7143
fosfaatbuffer bij 19 – 25°C (Chapman-Andressen, 1962). Volgens Johansson & Josefsson
(1984a, b) is Kalium een sterkere inducer dan Natrium en vormen ze verschillende
morfologische typen van pinocytose in Amoeba proteus. Onderzoek uitgevoerd door
Klopocka et al. (2000) geven met toevoeging van 0,125 mol/l KCl pinocytotische rozetten na
10 – 15 minuten. Na deze pinocytotische-rozet-fase komt de amoebe in een ‘postpinocytotic
form’ wat inhoud dat de amoebe opzwelt, onbewegelijk wordt en stopt met het opnemen van
voedsel. Hierdoor zal de amoebe verhongeren en uiteindelijk afsterven.
Het afsterven of het ontbreken van de gastheer van Legionella zal er uiteindelijk toe leiden
dat deze bacterie zich niet kan vermenigvuldigen of zich kan beschermen tegen chemische
bestrijdingsmiddelen. Hierdoor kan de algehele bestrijding van Legionella in diverse
watersystemen aanzienlijk worden vereenvoudigd. Bovendien heeft een verhoging van de
saliniteit tevens een negatief effect op Legionella en een biofilm. Onderzoek van Heller et al.
(1998) toonde aan dat de afname van het aantal Legionella-bacterien als gevolg van een
verhoogde zoutconcentratie (2 – 3% NaCl), voornamelijk plaatsvond gedurende de eerste
uren van blootstelling. Hierna bleef het aantal Legionella-bacterien constant. Dit kan een
indicatie zijn voor mogelijke aanpassing van Legionella aan een verhoogde saliniteit.
Onderzoek van Mayer et al. (1999) toonde aan dat toevoeging van elektrolyten als NaCl,
NaBr, KCl, MgCl en NH 4 Cl (concentratie tussen 0 en 0,3 mol/kg) de elektrostatische
interacties tussen de extracellulaire polymeren (xPS) in een biofilm kan veranderen waardoor
de viscositeit van de xPS vermindert.
1.2 Aanleiding project
Aanleiding van het project is het veel voorkomende probleem in de industrie van besmetting
van koelwatersystemen door Legionella-bacteriën. Normaliter wordt de microbiologische
groei in koelwatersystemen bestreden door het toevoegen van oxiderende en nietoxiderende
biociden. Dit soort toevoegingen lijkt niet (altijd) het gewenste effect te hebben op
Legionella-bacteriën. Bovendien moeten de doseringen soms zo sterk opgevoerd worden dat
enerzijds problemen kunnen ontstaan door het optreden van corrosie en anderzijds meer
biocide (vrij halogeen) wordt geloosd. Dit is in strijd met vigerend milieubeleid: voor de
basismetaalindustrie is in het ‘Integraal Meerjarenprogramma Milieuhygiëne’ vastgelegd dat
de lozing van vrij halogenen met 30% zou worden teruggebracht, dus 30% minder verbruik
van chloorbleekloog ten opzichte van het verbruik in 1995.
Ten gevolge van Legionella-bestrijding is het verbruik bij Corus Staal (> 90% van
basismetaalindustrie) juist sterk gestegen. Om te kunnen voldoen aan de doelstellingen uit
het Meerjarenprogramma dient dus een forse reductie plaats te vinden. Uit studies blijkt dat

-12- 50452040-KPS/MEC 04-7143
kalium-ionen ingrijpen in de fysiologie van de biocoenose van een biofilm. Met deze techniek
kan het mogelijk zijn om de groei van Legionella te voorkomen door bestrijding van amoeben
en de biofilm. Dit zou mogelijk kunnen door de biocoenose, de micro-leefgemeenschap zoals
deze groeit en samenleeft in een biofilm, kortdurend bloot te stellen aan een verhoogde
toevoeging van kalium-ionen, eventueel in combinatie met een surfactant voor een betere
indringing in de biofilm. Mogelijk kan met intermitterende dosering van een kalium-verbinding
preventief de aanwezigheid van Legionella worden bestreden, en is een reductie van 50%
van het huidige verbruik bij Corus Staal B.V. mogelijk. Bij volledig succes van de
voorgestelde techniek zal het chloorbleekloog verbruik dalen tot een minimaal niveau.
Voor de bestrijding van Legionella-bacteriën in industriële koelwatersystemen wordt op dit
moment in feite alleen gebruik gemaakt van het doseren van biocides. Deze methode is van
oudsher de techniek om biofilms te bestrijden en de nadelige invloed op de warmteoverdracht
die veroorzaakt wordt door biofilms, zo klein mogelijk te houden. Legionellabacteriën
zijn aanwezig in veel open circulerende koelwaterprocessen doordat de
omstandigheden (temperatuur, aanwezigheid van voedingsstoffen en gastheerorganismen in
de biofilm) het ideale milieu vormen voor de groei van dit soort bacteriën. Door KEMA in
samenwerking met Iv-Water zijn op laboratoriumschaal proeven uitgevoerd waarbij de
fysisch-chemische omstandigheden gedurende korte tijd zodanig werden gewijzigd door
toevoeging van een kalium-verbinding, dat in de biofilm aanwezige amoeben, welke dienen
als gastheer van de Legionella-bacteriën, worden geïnactiveerd en biofilm zelf desintegreert
(Janssen-Mommen et al., 2002). Door deze behandeling periodiek te herhalen kan mogelijk
de groei van Legionella-bacteriën voorkomen. De toepasbaarheid van deze techniek dient in
de praktijk bewezen te worden bij een met Legonella-bacteriën besmette koelsysteem.
Aangezien er ook bepaalde risico's aan het veranderen van de omstandigheden in het
koelwatersysteem vastzitten, is eerst onderzoek op een bypass van een koeltorensysteem
noodzakelijk
1.3 Doel
Bij Corus Staal is grote behoefte aan het terugbrengen van biociden gebruik, chloorbleekloog,
alsook een optimale bestrijding van Legionella. Bij gebleken toepasbaarheid zal
kalium-dosering het verbruik aan chloor doen afnemen. Doel is om, in een proefopzet bij
Corus, de mogelijkheid te onderzoeken of periodiek doseren van een kalium-verbinding, al of
niet in combinatie met een surfactant, een oplossing is voor de Legionella-problematiek in
het koelwatersysteem van de Continu Gietmachine van Oxystaalfabriek 2 van Corus.
Daarnaast moeten ook uitspraken gedaan kunnen worden over algemenere toepasbaarheid.

-13- 50452040-KPS/MEC 04-7143
2 EXPERIMENTELE OPZET
2.1 Uitvoering experimenten
De proeven hebben plaatsgevonden in een bypass van het koelwatersysteem van de
Continu Gietmachine van Oxystaalfabriek 2 (OSF2). De opstelling van het recirculatiexperiment
is opgebouwd in een mobiel laboratorium. Biofilm-vorming alsook het effect van
een intermitterende kalium-dosering op de activiteit van de biofilm is gevolgd met een on-line
monitoring systeem. Tijdens de dosering is de microbiologische activiteit via ATP-metingen,
de effecten op amoeben via microscopie, alsook Legionella-concentraties met de geëigende
uitplaat-techniek, gevolgd.
Fijnfilter sproeiers
Monsterpunt
Legionlla
Platen koelers (3) gesloten
koelsysteem gietvorm-machines
Koeltoren
Cl dosering
bassin
Monsterpunt 3: NZF
Gietmachine 21 & 22
Monsterpunt 1: RW
Zandfilters (6)
Bezinkbassin
Monsterpunt 2: VZF
Figuur 1. Schematische weergave van het koelwatersysteem van de OSF2.

-14- 50452040-KPS/MEC 04-7143
2.2 Mobiel laboratorium
Voor het onderzoek bij het koelwatersysteem van de Continu Gietmachine van de OSF2, is
het KEMA Mobiel laboratorium op locatie gezet (Figuur 2). Het water dat gebruikt is voor de
experimenten is in eerste instantie water gebruikt uit het bassin van de koeltoren. Later, na
gebleken negatieve effecten op de experimenten van de chlorering en toevoegingen van
biodispergant van het OSF2 koelwater, is het zogenaamde “A-water” (gedemineraliseerd
water) gebruikt. Voor de aanvoer van water in het Mobiel laboratorium is een aansluiting
gemaakt op de afvoerleiding van het koeltoren bassin.
Figuur 2. De koeltoren van de Continu Gietmachine van Oxystaalfabriek 2 met rechts op de
voorgrond het KEMA Mobiel Laboratorium.
In eerste instantie is de wateraanvoer aangesloten op een voorraadvat welke continue
doorstroomd werd. Vanuit dit vat werd met een dompelpomp het water in het TestRig
aangevuld (aangestuurd door een volautomatische niveaumeting en regeling in het bassin
van het TestRig).

-15- 50452040-KPS/MEC 04-7143
2.2.1 TestRig
De testen zijn uitgevoerd met behulp van het zogenaamde TestRig, een proefinstallatie
welke wordt toegepast voor de NEN 7420. De installatie, weergegeven in figuur 3, is
opgebouwd uit een warmtewisselaar, koelingsectie en sensoren voor de monitoring van
diverse procesparameters.
Figuur 3
Overzichtsschema TestRig. Van links naar rechts is te zien, voorraadvat C met
BioGeorge-sensor 1 en dompelpomp 4 voor suppletie, de koeltoren A met daaronder
de bassins B en B’ met daarin off-line saliniteitsmeter 2 alsook niveau
regeling. Daarna komt de warmtewisselaar D met vlak daarachter de Bio-
George-controller 1 en on line conductiviteitsmeter 3 (tezamen de sensorsectie
vormend) en helemaal rechts staat de vermogenskast E.
Een belangrijk onderdeel van de proefopstelling is de warmtewisselaar, welke bestaat uit zes
proefpijpen. In de pijpen wordt elektrische warmte gegenereerd met behulp van
verwarmingselementen. De verkregen warmte wordt via de pijpwand aan het omringende
proceswater afgestaan. In beginsel hebben de proefpijpen als functie microbiologische
activiteit, scaling en MIC vast te stellen. Tijdens dit onderzoek doen de proefpijpen dienst als
warmtegeleiders van het verwarmingselement naar het proceswater. Via een pomp wordt het
proceswater vanuit het bassin over de warmtewisselaars geleid, waarna het opgewarmde
proceswater door de sensorsectie stroomt. In deze sensorsectie is onder andere de
BioGeorge-sensor geïnstalleerd. Vervolgens bereikt het proceswater de koelsectie, hier
wordt de opgenomen warmte in de koeltoren door gedeeltelijke verdamping van het water
aan de omgeving afgegeven.

-16- 50452040-KPS/MEC 04-7143
Proefpijpen De installatie bevat zes roestvaststalen proefpijpen welke onderdeel uit maken
van de warmtewisselaar. Binnen in de pijpen kunnen één of twee elektrische
verwarmingselementen worden gemonteerd. Tussen de elementen en de pijpwand zijn in
een messingpijp temperatuuropnemers (thermokoppels of platina weerstandthermometers)
aangebracht, waarmee de veranderingen in temperatuur in de proefpijp zijn te registreren.
Elke proefpijp heeft een binnendiameter van 10 mm. en een buiten diameter van 14 mm. De
zes pijpen van de opstelling hebben allen dezelfde lengte. Per pijp worden twee
verwarmingselementen gebruikt (buitendiameter 6,5 mm). Om het verwarmingselement is
een messingpijp met een binnendiameter van 6,5 mm. en een buitendiameter van 10 mm.
geplaatst. In de wand van deze messingpijp zijn thermokoppels gemonteerd die de
temperatuur meten. De proefpijpen zijn concentrisch in de buitenmantels gemonteerd. Het
proceswater stroomt door de annulaire ruimte langs de buitenzijden van de proefpijp.
Warmtewisselaarsectie De warmtewisselaar omvat de zes buizen, elk bestaande uit een
proefpijp in een glazen buitenmantel. De glazen buitenmantels hebben een binnendiameter
van 25,4 mm. De zes warmtewisselaar buizen zijn horizontaal geplaatst en in serie met het
watercircuit opgenomen.
Vermogenskast De opwarming vindt plaats via elektrisch gegenereerde warmte met behulp
van verwarmings-elementen. Om deze elektrische warmte te kunnen opwekken is het
TestRig voorzien van een vermogenskast. Deze vermogenskast verzorgt de voeding van de
verwarmings-elementen. Het af te geven vermogen van de vermogenskast aan de
verwarmings-elementen kan worden ingesteld. Via een elektrische terugkoppeling van een
ingebouwde thermokoppel naar de vermogenskast wordt de temperatuur van het
verwarmingselement weergegeven op het display behorende bij een bepaalde
warmtewisselaarbuis. Met behulp van deze thermische terugkoppeling is een oververhitting
beveiliging gecreëerd, voor elke buis kan een temperatuur setpoint worden ingesteld.
Overschrijdt de teruggekoppelde waarde het setpoint dan wordt de installatie uitgeschakeld.
Circulatiepomp Via een centrifugaalpomp wordt het proceswater door de installatie
rondgepompt. Het actuele debiet kan bij werking van de installatie worden afgelezen van een
debietmeter in liters per minuut.
Bassin Het waterbassin heeft een inhoud van ongeveer 66 liter en is voorzien van een
niveau-regeling welke is gekoppeld aan een regelklep voor suppletiewater. Met behulp van
een debietmeter wordt de hoeveelheid gesuppleerd water geregistreerd. De debietmeter is
naast het weergeven van het actuele debiet ook uitgerust met een dagteller en totaalteller.
Net als de temperatuur is het waterniveau in het bassin gekoppeld aan een beveiliging.

-17- 50452040-KPS/MEC 04-7143
Wanneer de niveaumeters een hoog of laag niveau afgeven, wordt de installatie door de
beveiliging uitgeschakeld. Tevens is het bassin uitgerust met een spuiinrichting.
Koeltoren In de NEN 7420 (NEN, 1995) staat voorgeschreven dat de koeltoren moet zijn
voorzien van een druppelvanger. Het afzetten van zouten in de koeltoren wordt zoveel
mogelijk tegengegaan, dit kan met een zogenaamd open pakket. Volgens de NEN 7420 is
het toepassen van een filmvormend pakket niet toegestaan. Een open pakket is een pakket
in de koeltoeren waarbij het vallende water uiteenspat in zeer kleine druppels, waardoor
nergens opdroging in het pakket plaatsvindt. Het pakket is daardoor weinig gevoelig voor
zoutafzetting. Een filmvormend pakket is een pakket waarbij het vallende water als een
steeds dunner wordende film langs gegolfde wanden naar beneden glijdt, waarbij locale
opdroging kan plaatsvinden. Een filmvormend pakket is wel gevoelig voor zoutafzetting. Om
het inwendige van de koeltoren visueel te kunnen inspecteren tijdens de proef, bestaat de
behuizing van de toren uit doorzichtig materiaal. De koeltoren is tijdens de experimenten op
OSF2 niet voorzien van een ventilator.
Monitoring procesparameters Het verloop van de praktijktesten wordt gemonitored aan de
hand van een aantal procesparameters, namelijk:
- temperatuur na warmtewisselaar
- temperatuur bassin
- pH
- saliniteit / conductiviteit (µS/cm of mS/cm)
- debiet proceswater
- chloorconcentratie (TRO/FO).
De temperatuur zowel na de warmtewisselaar en in het bassin, de pH (zuurgraad), de
saliniteit/conductiviteit en het zuurstofgehalte, worden met een zogenaamde Multiliner
gemeten. Aan deze handmeter kunnen verschillende elektroden worden gekoppeld welke
vervolgens de betreffende parameter bepaald. De pH wordt bepaald door een elektrode die
direct na de warmtewisselaar in de leiding is geplaatst, met dezelfde elektrode wordt ook de
temperatuur na de warmtewisselaar gemeten. In het bassin is een elektrode geplaatst, welke
de EGV en de temperatuur van het water in het bassin vaststelt. Tevens wordt, wanneer dat
gewenst is, de zuurstofelektrode in het bassinwater gehangen, zodat het zuurstofgehalte van
het proceswater kan worden geregistreerd.
In het systeem, zowel in het aanvoerbassin als in het TestRig is tijdens de bezoeken ook de
chloorconcentratie gemeten met behulp van een handmatige chloormeting (HACH DR2000),
zowel TRO (Total Residual Oxidant) als FO (Free Oxidant).

-18- 50452040-KPS/MEC 04-7143
De chloorconcentratie in het koelwatersysteem van OSF2 wordt niet continu geregistreerd,
hetgeen een groot gemis is. Hierdoor is het niet mogelijk om eenduidig de ‘events’ van
verhoogde chloorconcentratie vast te stellen. Deze events doen zich voor indien bij een
verhoogd gemeten Legionella-gehalte extra chloor wordt gedoseerd. Daarom is gebruik
gemaakt van de gemeten Legionella-waarden. Bij overschrijding van de norm wordt opdracht
gegeven de chloorcentratie gedurende drie dagen te verhogen tot 0,5 ppm TRO. In de
overige perioden wordt aangenomen dat de chloorconcentratie gemiddeld 0,1 – 0,15 ppm
TRO is.
Figuur 4. Overzichtsfoto van het TestRig. Van links naar rechts is te zien, de koeltoren met
daaronder het bassin, de warmtewisselaar unit die gevoed wordt met water uit het
bassin. Vervolgens geheel links de kast (metaal) voor registratie van de diverse
data.

-19- 50452040-KPS/MEC 04-7143
2.3 Microbiologische monitoring en analyse
2.3.1 Biofilm monitoring
Om de toepasbaarheid van de dosering van de kalium-verbinding te kunnen bepalen, is een
biofilm activiteitsmonitor toegepast die gebruik maakt van een sensor waarop de afzetting
van biofilm wordt gestimuleerd. Dit systeem genaamd BioGeorge heeft zich bewezen in de
industrie als zijnde een robuust monitoringsysteem ter bepaling van biologische afzettingen
in koelwatersystemen (Fallon, 2004). Bovendien is met het systeem de mate van biofilm
bestrijding duidelijk waarneembaar (Bruijs et al., 2001, Venhuis et al., 1998a,b). De
toepassing en werking van dit systeem wordt in bijlage A nader toegelicht.
Ter registratie van de effecten van kalium-dosering is een systeem permanent ingebouwd in
het TestRig, tussen de warmtewisselaar en de koeltoren. De andere is geplaatst in het
voorraadvat en heeft gedurende de testperiode geen biofilm waargenomen. Bovendien heeft
een tweede BioGeorge gedurende een periode als back-up meegedraaid in het TestRig
bassin. Omdat de trend van beide systemen identiek is zijn deze waarden niet opgenomen in
deze rapportage. Een BioGeorge systeem registreert de afzetting van een biofilm aan de
hand van applied- en generated-current signalen (zie bijlage A). Deze volgen echter dezelfde
trend en worden toegepast ter controle van het meetapparaat. Omdat het in deze rapportage
gaat over de effecten van kalium-dosering op de activiteit van de biofilm is gebruik gemaakt
van applied-current grafieken ter visualisatie van de eventuele effecten.
2.3.2 ATP
De microbiële effectiviteit is bepaald door een metabolische enzymbepaling, gebaseerd op
de meting van adenosine-5’-triphosphate (ATP). ATP is een energierijke verbinding die voorkomt
in alle organismen, als energieopslagsysteem. Het gehalte aan ATP kan nauwkeurig
via bioluminescentie worden gemeten. Bij bioluminescentie wordt de hoeveelheid licht gemeten
die wordt geëmitteerd tijdens de omzetting van ATP. De hoeveelheid ATP kan niet
direct gerelateerd worden aan een hoeveelheid micro-organismen omdat de hoeveelheid
ATP per micro-organisme niet altijd gelijk is, maar dient als een maat voor de aanwezige biomassa
en activiteit van micro-organismen in een monster. Bij deze activiteitsmeting wordt
onderscheid gemaakt tussen ATP van dode (vrij ATP in de waterfase) en van levende microorganismen
(totaal ATP – vrij ATP). De mate van bioluminescentie wordt uitgedrukt in
Relative Light Units (RLU).

-20- 50452040-KPS/MEC 04-7143
2.3.3 Legionella
De Legionella-bepalingen zijn uitgevoerd door Streeklaboratorium Haarlem voor de
volksgezondheid Kennemerland, volgens de hiervoor bestaande NEN-methodiek (NEN
6265, Bacteriologisch onderzoek van water). Aangeleverd zijn water- en swap-monsters.
Voor de swap-monsters wordt een oppervlak van 8 cm 2 gebruikt. De resultaten van de swapmonsters
zijn daardoor uitgedrukt in KVE/cm 2 .
2.3.4 Amoeben
Voor de bepaling van amoeben zijn zowel monsters genomen van het water als de biofilm.
Deze zijn opgestuurd naar een laboratorium in Duitsland voor specifieke analyse. De
determinatie-testen zijn uitgevoerd op voedselarme agar-platen (non-nutrient agar; NNA)
volgens Page (1988). Deze agar-platen zijn aangeënt met de Phyllobacterium, "Mü"-stam als
voedsel voor de amoeben. Na het overbrengen van verschillende amoeben soorten, zijn de
platen onder observatie geplaatst bij kamertemperatuur gedurende de eerste 60 min. Daarna
zijn de platen geïncubeerd bij 28°C. Er zijn tevens kalium-tolerantie-testen uitgevoerd met
KCl, zowel voor amoeben als voor de aanwezige cysten.
2.4 Uitvoering experimenten:
Ter bepaling van de effectiviteit van een kalium-verbinding in de bestrijding van een biofilm,
amoeben en de Legionella-bacterie is uitgegaan van de resultaten zoals waargenomen
tijdens doseringen met rivierwater op het KEMA-laboratorium te Arnhem. De volgende
hieronder beschreven experimenten zijn uitgevoerd op de ontwikkelde biofilm in het TestRig
bij OSF2.
2.4.1 Test 1: Dosering 3 gr/l Kaliumchloride
Op 21/4 is de ontwikkelde biofilm blootgesteld aan een kaliumchloride-concentratie van 3 gr/l
(concentratie kalium van 0,04 mol/l). Voor en na de dosering zijn er Legionella-monsters
genomen van de biofilm, met behulp van een swap. Tevens zijn er watermonsters genomen
uit het bassin van het TestRig ter bepaling van Legionella in de waterfase, voor en na
dosering. Voor de analyse van amoeben zijn ook twee swaps genomen van de biofilm. Ook
zijn ter bepaling van de activiteit van de biofilm ATP-bepalingen uitgevoerd aan de biofilm en
aan de waterfase voor en na de kaliumchloride-dosering. Ter bepaling van de juiste

-21- 50452040-KPS/MEC 04-7143
kaliumchloride-concentratie is de geleidbaarheid (mS/cm) van een liter TestRig-water met
toevoeging van 3 gram KCl bepaald. Deze watergeleiding is vervolgens in het TestRig
ingesteld door toevoeging van KCl aan het TestRig, zoals weergegeven in figuur 5.
14
35
12
30
Geleidbaarheid & KCl-conc.
10
8
6
4
25
20
15
10
Temperatuur
2
5
0
0
20-Apr-04
21-Apr-04
22-Apr-04
23-Apr-04
24-Apr-04
25-Apr-04
Geleidbaarheid (mS/cm) KCl-conc (gr/l) Temperatuur (°C)
Figuur 5. Overzicht van de geleidbaarheid (mS/cm) in het TestRig-water gedurende de
dosering van 3 gr/l KCl (21 April 11:18uur tot 23 April 12:30uur).
2.4.2 Test 2: Dosering 17,5 gr/l Kaliumdiwaterstoffosfaat
Op 04/8 is besloten de ontwikkelde biofilm bloot te stellen aan een hogere kaliumconcentratie.
De in de literatuur vermelde kalium-concentratie van 0,125 mol/l die nodig is
voor het optreden van pinocytose bij amoeben is gedoseerd in the TestRig. Besloten is om
gebruik te maken van kaliumdiwaterstoffosfaat in plaats van kaliumchloride. De reden
hiervoor is dat een te hoge chloride-concentratie schade kan veroorzaken aan diverse
materialen in het koelwatersysteem. Een bijkomend voordeel van fosfaat is dat het
corrosieremmende eigenschappen bezit. Voor het bereiken van een concentratie van 0,125
mol/l kalium wordt 17,5 gr/l KH 2 PO 4 in het TestRig gedoseerd (= 0,128 mol/l kalium). Voor en
na dosering zijn er Legionella-monsters genomen van de biofilm, met behulp van een swap.
Tevens zijn er watermonsters genomen uit het bassin van het TestRig ter bepaling van
Legionella in de waterfase, voor en na dosering. Ook zijn ter bepaling van de activiteit van de
biofilm ATP-bepalingen uitgevoerd aan de biofilm en aan de waterfase voor en na de
kaliumdiwaterstoffosfaat dosering. Ter bepaling van de juiste kaliumdiwaterstoffosfaatconcentratie
is de geleidbaarheid (mS/cm) van een liter TestRig water met toevoeging van

-22- 50452040-KPS/MEC 04-7143
17,5 gr/l KH 2 PO 4 bepaald. Deze watergeleiding is vervolgens in het TestRig ingesteld door
toevoeging van KH 2 PO 4 aan het TestRig, zoals weergegeven in figuur 6.
20
50
18
45
16
40
Geleidbaarheid & KH2PO4-conc.
14
12
10
8
6
35
30
25
20
15
Temperatuur
4
10
2
5
0
0
4-Aug-04
5-Aug-04
6-Aug-04
7-Aug-04
8-Aug-04
Geleidbaarheid (mS/cm) KH2PO4-con (gr/l) Temperatuur (°C)
Figuur 6. Overzicht van de geleidbaarheid (mS/cm) in het TestRig-water gedurende de
dosering van 17,5 gr/l KH 2 PO 4 (4 Augustus 11:40uur tot 5 Augustus 10:30uur).
2.4.3 Test 3: Dosering 17,5 gr/l Kaliumdiwaterstoffosfaat met surfactant
Op 21/9 is besloten de ontwikkelde biofilm bloot te stellen aan een surfactant en daarna aan
een kalium-concentratie van 0,125 mol/l. De surfactant, genaamd Bewacool B725, dient
ervoor de biofilm beter beschikbaar te maken voor het te doseren kalium. Besloten is om
weer gebruik te maken van kaliumdiwaterstoffosfaat in plaats van kaliumchloride. Voor het
bereiken van een concentratie van 0,125 mol/l kalium wordt 17,5 gr/l KH 2 PO 4 in het TestRig
gedoseerd. Voor en na doseringen van surfactant en kalium-verbinding zijn er Legionellawatermonsters
genomen. Ook zijn ter bepaling van de activiteit van de biofilm ATP-metingen
uitgevoerd aan de biofilm en aan de waterfase voor en na dosering van surfactant en
kaliumdiwaterstoffosfaat. Ter bepaling van de juiste hoeveelheid surfactant wordt uitgegaan
van de informatie van de leverancier dat maximaal 50 ml product noodzakelijk is voor een m 3
koelwater. De periode tussen surfactant-dosering en de dosering van de KH 2 PO 4 is 30 min.
Ter bepaling van de juiste concentratie kaliumdiwaterstoffosfaat is de geleidbaarheid

-23- 50452040-KPS/MEC 04-7143
(mS/cm) van een liter TestRig-water met toevoeging van 17,5 gr/l KH 2 PO 4 bepaald. Deze
geleidbaarheid is vervolgens in het TestRig ingesteld door toevoeging van KH 2 PO 4 aan het
TestRig, zoals weergegeven in figuur 7.
20
50
18
45
16
40
Geleidbaarheid & KH2PO4-conc.
14
12
10
8
6
35
30
25
20
15
Temperatuur
4
10
2
5
0
0
19-Sep-04
20-Sep-04
21-Sep-04
22-Sep-04
23-Sep-04
Geleidbaarheid (mS/cm) KH2PO4-conc. (gr/l) Temperatuur (°C)
Figuur 7. Overzicht van de geleidbaarheid (mS/cm) in het TestRig gedurende de dosering
van 175 gr/l KH 2 PO 4 (21 September 12:10uur tot 22 September 14:00uur).

-24- 50452040-KPS/MEC 04-7143
3 RESULTATEN
3.1 Biofilm monitoring, ATP- en Legionella-bepalingen
3.1.1 Resultaten test 1: Dosering Kaliumchloride
In figuur 8 staan de resultaten weergegeven van de BioGeorge monitor in het TestRig
gedurende de periode van polarisatie (applied-current) en de ATP analyses uitgevoerd aan
waterfase en biofilm. Uit de resultaten is waarneembaar dat na de periode (12/3 – 15 /3) van
basislijn stabilisatie (geel) de monitor een verhoging van biofilm activiteit gedurende de
periode 15/3 – 24/4 waarneemt. Dit resulteert in het in alarm gaan van de monitor op 31/3.
Uit de ATP analyses aan de wand is een trend van deze toename van activiteit ook duidelijk
waarneembaar. De schommelingen in activiteit zoals bijvoorbeeld de afname in activiteit na
7/4 is veroorzaakt door een verhoogde chloorbleekloog dosering van 0,6 TRO omdat de
Legionella-bepaling van 31/3 een kiemgetal opleverde van 18.000 KVE/L. Deze toename
van chloorbleekloog in het aanvoerbassin heeft tevens afdoding veroorzaakt van biofilm in
het TestRig, wat waarneembaar is door een vermindering in activiteit geregistreerd door de
BioGeorge.
Applied Current Data
6.0
300000
5.0
250000
Applied Current, microAmps
4.0
3.0
2.0
27-Apr-04
25-Apr-04
23-Apr-04
21-Apr-04
19-Apr-04
17-Apr-04
15-Apr-04
13-Apr-04
11-Apr-04
9-Apr-04
7-Apr-04
5-Apr-04
3-Apr-04
1-Apr-04
30-Mar-04
28-Mar-04
26-Mar-04
24-Mar-04
22-Mar-04
20-Mar-04
18-Mar-04
16-Mar-04
14-Mar-04
12-Mar-04
10-Mar-04
8-Mar-04
200000
150000
100000
ATP activiteit (RLU)
1.0
50000
0.0
0
3-May-04
1-May-04
29-Apr-04
Safe mode Trend Evaluating mode Trend Alarm mode Trend ATP waterfase /ml ATP Biofilm /cm²
Figuur 8.
Resultaten applied-current van de BioGeorge monitor in het TestRig.

-25- 50452040-KPS/MEC 04-7143
Op 21/4 is vanwege de hoeveelheid biofilm dat zich ontwikkeld heeft in het TestRig, KCloplossing
gedoseerd in een concentratie van 3 gr/l. BioGeorge- en ATP-resultaten geven
gedurende een doseerperiode van 3 dagen (21/4 – 23/4) geen significante afname van
biofilm activiteit. Ook geven Legionella-analyses uitgevoerd voor en na dosering van 3 gr/l
KCl geen significante afname. ATP- en Legionella-resultaten zijn weergegeven in Tabel
Tabel 1. Resultaten ATP- en Legionella-analyses in het TestRig-bassin over de periode 12
Maart tot 24 April 2004.
Datum tijd Waterfase
RLU/ml
ATP
Biofilm
RLU/cm2
Legionella
Waterfase
KVE/L
Biofilm
KVE/cm2
18 Maart 12:45uur 34.170
23 Maart 17:00uur 15.360 8.370
24 Maart 10:00uur 4.000
06 April 14:00uur 18.740 175.750
15 April 12:00uur 22.650 169.970
20 April 13:00uur 6.670 137.450
21 April 10:00uur 41.880 295.890 56.000 / 100.000 1.250 / 1.250
11:18uur Start dosering KCl 3 gram/L
11:42uur 27.280
12:10uur 27.700
12:40uur 31.200
13:10uur 24.450
13:45uur 28.640 305.750
14:40uur 29.280
15:00uur 32.700
15:30uur 21.040 171.760
16:30uur 900.000 / 600.000 1.250 / 12.500
16:40uur 20.950
17:00uur 1.200.000 / 1.200.000
23 April 12:30uur 900.000 / 700.000 1.250 / 1.250
3.1.2 Resultaten test 2: Dosering Kaliumdiwaterstoffosfaat
Op 24/4 is het water in het TestRig ververst met koelwater van Corus en is er gestart met
een vernieuwde stimulatie van biofilm opbouw. Een storing op 17/5 veroorzaakt door het
doorslaan van een aardlekschakelaar heeft geresulteerd in het droogvallen van het TestRig
waardoor de biofilm is afgedood. Op 5/6 is opnieuw gestart met de stimulatie van biofilm
opbouw. Na 21 dagen (8/6 – 29/6) is er nog geen toename geregistreerd in biofilm activiteit.

-26- 50452040-KPS/MEC 04-7143
Dit wordt veroorzaakt door een verhoogde chloorbleekloog-dosering in het koelwatercircuit
van Corus door detectie van een verhoogde Legionella-concentratie gedurende de periode
9/6 – 7/7. Op 29/6 is de BioGeorge sensor gedemonteerd en bekeken, hierop was geen
microbiële aangroei aanwezig. Besloten is het aanvoerbassin te vullen met demiwater, dit ter
compensatie van verdamping in de koeltoren. Wekelijks is 20 liter water in het TestRig
vervangen voor ‘verouderd’ koelwater om uitputting van voedingsstoffen voor de groei van
de microbiologie te voorkomen. Dit ‘verouderd’ water is koelwater van Corus dat een week
ervoor is afgetapt, zodat de chloorverbindingen grotendeels zijn verdwenen.
Op 29/6 is opnieuw gestart met de stimulatie van biofilm opbouw. Na 21 dagen (30/6–20/7)
wordt er op de BioGeorge sensor een verandering in activiteit waargenomen en is een
duidelijke stijging in biologische activiteit waarneembaar (grafiek) over de periode 20/7 – 4/8
van 0,52 tot 1,24 µA. Uit de ATP-analyses aan de wand, weergegeven in figuur 9 en tabel 2
is de trend van deze toename van activiteit ook duidelijk waarneembaar. De activiteit is
toegenomen van 66.490 RLU/cm 2 op 8/7 tot 119.300 RLU/cm 2 op 4/8.
Op 4/8 is vanwege de hoeveelheid biofilm dat zich ontwikkeld heeft in het TestRig, KH 2 PO 4 -
oplossing gedoseerd in een concentratie van 17,5 gr/L. BioGeorge- en ATP-resultaten geven
gedurende een doseerperiode van 24 uur (tot 5/8 12:00 uur) geen significante afname van
biofilm activiteit. Ook geven Legionella-analyses uitgevoerd voor en na dosering van 17,5 gr/l
KH 2 PO 4 geen significante afname. In Tabel 2 worden de ATP- en Legionella-resultaten
weergegeven.
Tabel 2. Resultaten ATP- en Legionella-analyses in het TestRig-bassin over de periode 24
April tot 5 Augustus 2004.
Datum tijd Waterfase
RLU/ml
ATP
Biofilm
RLU/cm2
Legionella
Waterfase
KVE/L
Biofilm
KVE/cm2
15 Mei 10:45uur 5.360 113.600
24 Juni 11:15uur 22.120 21.560
8 Juli 12:15uur 27.100 66.490
4 Augustus 11:00uur 7.000 119.300 60.000 / 100.000 875 / 2.125
11:40uur Start dosering KH 2 PO 4 17,5 gram/L
13:30uur 1.300 208.700
5 Augustus 10:30uur 4.000 235.900 100.000 / >100.000 875 / 750

-27- 50452040-KPS/MEC 04-7143
Applied Current Data
6.0
300000
5.0
250000
Applied Current, microAmps
4.0
3.0
2.0
200000
150000
100000
ATP activiteit (RLU)
1.0
50000
0.0
0
11-Aug-04
7-Aug-04
Safe mode Trend Evaluating mode Trend Alarm mode Trend ATP waterfase /ml ATP Biofilm /cm²
Figuur 9.
16-Jun-04
12-Jun-04
8-Jun-04
4-Jun-04
31-May-04
27-May-04
23-May-04
19-May-04
15-May-04
11-May-04
7-May-04
3-May-04
29-Apr-04
25-Apr-04
3-Aug-04
30-Jul-04
26-Jul-04
22-Jul-04
18-Jul-04
14-Jul-04
10-Jul-04
6-Jul-04
2-Jul-04
28-Jun-04
24-Jun-04
20-Jun-04
Resultaten applied-current van de BioGeorge monitor in het TestRig over de
periode 24 April tot 11 augustus 2004.
3.1.3 Resultaten test 3: Dosering Kaliumdiwaterstoffosfaat met surfactant
Op 6/8 is opnieuw gestart met de stimulatie van biofilm opbouw. Na 14 dagen (6/8 – 20/8)
wordt er op de BioGeorge sensor een verandering in activiteit waargenomen en is een
duidelijke stijging in biologische activiteit waarneembaar (grafiek) over de periode 20/8 – 21/9
van 1,0 tot 2,86 µA. Uit de ATP-analyses aan de wand, weergegeven in figuur 10 en tabel 3
is de trend van deze toename van activiteit ook duidelijk waarneembaar. De activiteit is
toegenomen van 67.320 RLU/cm 2 op 23/8 tot 240.900 RLU/cm 2 op 21/9.
Op 21/9 is vanwege de hoeveelheid biofilm die zich ontwikkeld heeft in het TestRig, de
surfactant Bewacool B725 gedoseerd, volgens de specificaties van de leverancier (firma
BeWasol te Venray). Na een periode van 30 minuten is er een KH 2 PO 4 -oplossing gedoseerd
in een concentratie van 17,5 gr/l. BioGeorge- en ATP-resultaten geven gedurende een
doseerperiode van 24 uur (tot 22/9 14:00 uur) geen significante afname van biofilm activiteit.
Ook geven Legionella-analyses uitgevoerd voor- en na-dosering van 17,5 gr/l KH 2 PO 4 geen
significante afname. De ATP- en Legionella-resultaten zijn weergegeven in Tabel 3.

-28- 50452040-KPS/MEC 04-7143
Applied Current Data
6.0
300000
5.0
250000
Applied Current, microAmps
4.0
3.0
2.0
200000
150000
100000
ATP activiteit (RLU)
1.0
50000
0.0
0
27-Sep-04
19-Sep-04
11-Sep-04
3-Sep-04
26-Aug-04
18-Aug-04
10-Aug-04
2-Aug-04
25-Jul-04
17-Jul-04
9-Jul-04
1-Jul-04
23-Jun-04
15-Jun-04
7-Jun-04
30-May-04
22-May-04
14-May-04
6-May-04
28-Apr-04
Safe mode Trend Evaluating mode Trend Alarm mode Trend ATP waterfase /ml ATP Biofilm /cm²
Figuur 10.
Resultaten applied-current van de BioGeorge monitor in het TestRig over de
periode 06 Augustus tot 29 September 2004
Tabel 3. Resultaten ATP- en Legionella-analyses in het TestRig-bassin over de periode 06
Augustus tot 23 September 2004.
Datum tijd Waterfase
RLU/ml
ATP
Biofilm
RLU/cm2
Waterfase
KVE/L
23 Augustus 10:30uur 1.700 67.320
10 September 12:50uur 2.350 70.440
15 September 11:30uur 5.750 164.190
21 September 11:00uur 1.340 240.900 20.000 / 2.100
11:20uur Dosering Bewacool B725
12:00uur 2.380 105.970 2.100 / 8.000
12:10uur Start dosering KH 2 PO 4 17,5 gr/L
22 September 11:00uur 1.400 112.700 20.000 / negatief
Legionella
Biofilm
KVE/cm2

-29- 50452040-KPS/MEC 04-7143
3.2 Determinatie amoeben en overige protozoa in koelwater van de OSF2
In onderstaande tabel staan de soorten protozoa weergegeven die in de water- en
biofilmmonsters (februari 2004) van OSF2 zijn geïdentificeerd.
Tabel 4.
Determinatie amoeben en andere protozoa in het koelwater van OSF2.
Monsterplaats Vrijlevende amoeben Ciliaten en flagellaten Andere organismen
Ruw water (14°C) Vannella platypodia - -
(suppletie)
Vannella sp.
Basin water (35°C) - - -
water + biofilm van
lamellen bovenin
de koeltoren (55°C)
Vannella platypodia
V. simplex
V. sp.
Vexillifera bacillipedes
Hartmannella vermiformis
Filamoeba nolandi
Rosculus sp.
Testacea:
Cryptodifflugia-achtige
soorten
Oxytricha fallax
Chilodonella uncinata
Litonotus sp.
Urostyla sp.
een hypotrichous ciliaat
1 onbekende soort
flagellaten:
Bodo saltans
Rhynchomonas nasuta
2 andere nanoflagellaten
eencellige algen
filamenteuze algen
e.g. Cladophora
Diatomeeën
Enkele schimmels,
blauwe en groene
algen
Rotatoria
Er zijn slechts twee soorten protozoa uit de watermonsters geïsoleerd, twee Vannellasoorten
in het ruwe water. Het water/biofilm monster herbergde 7 soorten vrijlevende
amoeben, een lid van de Testacai, 6 ciliaten, 4 nanoflagellaten en verscheidene andere
organismen zoals groene algen, diatomeeën, enkele schimmels en rotiferen. Vannella en
Hartmannella kunnen als gastheer voor Legionella optreden.
3.3 Bepaling van amoeben en andere protozoa in het TestRig
De biofilm swap-samples op 21 April zijn genomen tijdens de dosering van KCl in het
TestRig. Alle biofilm-monsters zijn genomen van een roestvaststalen plaat die in het TestRigbassin
is geplaatst. Tabel 5 toont de resultaten van de biofilm swap-samples. De NN-agar
zijn geobserveerd gedurende een periode van 10 dagen. De nanoflagellaten bleken de
meest dominante soort te zijn in de meeste samples. Ciliaten zijn alleen sporadisch
gevonden omdat het per locatie 1 sample betrof en de voedingsbodem niet optimaal is voor
ciliatengroei.

-30- 50452040-KPS/MEC 04-7143
Tabel 5. Effect KCl-dosering in TestRig op amoeben en overige protozoa.
Sample Opmerkingen 30h 48h Amoebe soorten Overige soorten
19/04/2004
1 - + + Guttulinopsis,
Cochliopodium
Nanoflagellaten,
Nematoden
2 - + ++ Vannella sp.,
V.simplex, V. platypodia,
Cashia,
1 kleine Vahlkamphid soort
2 Testaceae sp.
Nanoflagellaten
Litonotus, Aspidisca,
andere Ciliaten
21/04/2004
1 Voor dosering ++ +++ Echinamoeba,
Vannella platypodia,
Nanoflagellaten
Nematoden + eieren
2 kleine onbekende soorten
2 Voor dosering ++ +++ Echinamoeba,
2 Vexillifera, V. platypodia,
3 Nanoflagellaten,
Nematoden
Acanthamoeba triangularis
3 Na dosering
3 g/l KCL
gedurende 3 hr
+ +++ Echinamoeba,
Thecamoeba striata,
Protacanthamoeba,
Vexillifera,
Hartmannella sp.,
Guttulinopsis
2 Testaceae,
Nanoflagellaten,
Chilodonella,
Cyclidium,
andere Ciliateen
Nematoden
4 Na dosering
3 g/l KCL
gedurende 3 hr
+ ++ Acanthamoeba triangularis,
A. polyphaga-type
Nanoflagellaten,
Nematoden,
Rotiferen
+ langzame groei, ++ matige groei, +++ sterke groei (betreft enkel groei van amoeben!).
Voor de KCl-tolerantie-test in het lab (tabel 6) zijn 4 verschillende amoeben soorten gebruikt,
drie welke zijn geïsoleerd uit de monsters van de OSF2 en een Acanthamoeba rhysodes
stam uit het laboratorium. De Vanella was de meest gevoelige stam die getest is, daar de
andere stammen verschillende maten van resistentie tegen verscheidene KCl concentraties
laten zien. In het geval van Acanthamoeba en in mindere mate bij Hartmannella lijkt het erop
of verschillende amoeben herstelden of geadapteerd raakten aan de concentratie waaraan
ze werden blootgesteld na een periode van 24 uur.

-31- 50452040-KPS/MEC 04-7143
Tabel 6.
KCl –tolerantie van 4 verschillende soorten vrijlevende amoeben
(r = rounded, l gedeeltelijk gelyseerd).
Amoeba-species KCL-conc. 10' 30' 60' 12h 24h
(%)
Vannella platypodia 0-controle + +++ +++ +++ +++
(OSF2) 2 ++ ++ ++ -
2,5 +++ +++ +++ -
3 ++ 50% l v. 10' v. 10' -
5 + 80% l + 90% l ~98% l -
Hartmannella 0-controle +++ r +++ +++ +++ +++
vermiformis
(OSF2) 2 +++ r +++ +++ (+) geen groei ++ -
2,5 ++ ++ ++ - -
3 ++ v.10' ++ - -
5 ++ r, l v.10' + r - -
Filamoeba nolandi 0-controle +++ +++ +++ +++ +++
(OSF2) 2 ++ +++ ++ +++ +++
2,5 + ++ ++ r, l (+) geen groei v.12h
3 + + r, l + 90% l - -
5 ++ + >90% l v.30' - -
Acanthamoeba 0-controle +++ +++ +++ +++ +++
rhysodes
(Koblenz) 2 +++ ++ ++ ++ +++
2,5 + r, l v. 10' v.10' (+) geen groei +
3 + l + l (+) l (+) geen groei +
5 ++ r, l v.10' v.10' (+) geen groei -
Hiernaast zijn cysten van Hartmannella en Acanthamoeba op een en dezelfde plaat
blootgesteld aan hogere concentraties aan KCl om hun ‘gedrag’ te observeren. De cysten
kwamen niet uit (transformatie naar trophozoït stadia) en zijn na 24 uur herplaatst op een
agar-bodem zonder KCl om te kijken of ze nu wel eventueel uitkwamen. De periode voor het
uitkomen (zg. Hatchen) onder normale condities varieert van stam tot stam en kan tot enkele
dagen duren. De resultaten van het plaatsen van de vier stammen in de 0,3% KCl-oplossing
(300 mg/100ml) zijn als volgt:

-32- 50452040-KPS/MEC 04-7143
Het trophische stadium van de vier stammen op de NN-agar platen zijn gesuspendeerd in
0,3% KCl opgelost in een zoutoplossing, ‘amoebal saline’ (AS) (Page, 1988) en als controle
in AS zonder toevoeging van KCl. De observaties zijn gemaakt na 10 en 90 minuten met
behulp van een binoculair bij 100x en 400x vergroting. De enige reactie was dat de Vanellae
meer samengetrokken leken in de KCl oplossing in vergelijking met de controle. Ondanks dit
kleine verschil vormden ze binnen 10 minuten drijvende vormen in beide oplossingen
(normaal bevind een amoebe zich op het oppervlak, zich laten wegdrijven maakt migratie
mogelijk). Er waren geen verschillen in gedrag tussen de trophische stadia van de drie
soorten in vergelijking tot de controle zonder KCl. Voordat de gebruikte agarplaten van de
voorgaande KCl-assays werden afgevoerd, werden deze na 10 dagen geïnspecteerd op de
aanwezigheid van amoeben. Zoals te zien is in de tabel 4 werden cysten en in enkele
gevallen ook zich vermenigvuldigende trophozoïten aangetroffen, zelfs op de platen die vrij
leken van levende amoeben na 24 uur. Enkele overlevende exemplaren moeten zijn hersteld
en zich hebben aangepast aan de KCl-concentratie. Alleen Vannellae als de meest
gevoelige soort kon op geen enkele KCl verrijkte agar-plaat worden gevonden.
Tabel 4.
KCl-tolerantie na 10 dagen:
Soort (herkomst) KCL-concentratie (%) Na 10 dagen
Vannella platypodia 0-control +++
(Arnhem) 2 -
2,5 -
3 -
5 -
Hartmannella vermiformis 0-control +++
(Arnhem) 2 +++
2,5 ++
3 ++
Filamoeba nolandi 0-control +++
(Arnhem) 2 ++
2,5 ++
3 ++
5 -
Acanthamoeba rhysodes 0-control +++
(Koblenz) 2 +++
2,5 +++
3 +++
5 -

-33- 50452040-KPS/MEC 04-7143
Cysten overgebracht op 5% KCl agar:
24h
48h
Cysten van Acanthamoebae op 5%KCL-plates (24h) ++ +++
Cysten van Hartmannellla op 5%KCL-plates (24h) ++ +++
Cysten van Hartmannellla op 3%KCL-plates (24h) ++ +++
De cysten van beide soorten zijn niet beïnvloed door de aanwezigheid van de
zoutconcentraties in een periode van 24 uur.
Op 21 en 22 September zijn swap-samples genomen ter detectie van amoeben, en het effect
van surfactant en kalium (0,128 mol/l). Geen invloed (zie onderstaande tabel) is
waargenomen van de diverse doseringen op de aanwezigheid van amoebe.
Monster nr. Datum Monstername Na 6 dagen Aanwezigheid levende
soorten Amoebe
KEMA 1 21.09.04 voor dosering + 1
KEMA 2 21.09.04 voor dosering + 1
KEMA 1 21.09.04 na surfactant dosering + 2
KEMA 2 21.09.04 na surfactant dosering (+) 2
KEMA 1 23.09.04 na kalium dosering ++ 3 (+Ciliates)
KEMA 2 23.09.04 na kalium dosering ++ 3
4 DISCUSSIE EN CONCLUSIES
Volgens de diverse onderzoeken zoals in deze rapportage besproken, blijkt dat kalium-ionen
in lage concentraties invloed hebben op de biocoenose van een biofilm met daarin
aanwezige pathogene micro-organismen als amoeben en Legionella. Dit is bevestigd door
KEMA-onderzoek. Dosering, uitgevoerd in oplopende concentratie, in zoet-(rivier)water
toonde een aanzienlijke vermindering in biofilm-activiteit aan bij relatief lage KClconcentraties
als 2,5 gr/l. Amoeben in het water van OSF2 blijken echter resistenter te zijn
voor hogere zoutconcentraties. Dit wordt bevestigd door de resultaten van de KCl-tolerantietest
aan biofilmmonsters uit de koeltoren van OSF2, uitgevoerd in het Duitse lab. Deze

-34- 50452040-KPS/MEC 04-7143
resultaten laten zien dat de groei van de meeste soorten amoeben op een agarvoedingsbodem
wordt geremd vanaf 2,5% KCl (= 25 gr/l).
Ter bestrijding van Legionella in het koelwatersysteem van OSF2 bij Corus Strip Products is
daarom als uitgangspunt genomen de dosering van kalium-ionen te richten op de bestrijding
van een biofilm. Bij het ontbreken van een biofilm is de voedingsbron van de amoebe
verdwenen en de afwezigheid van amoeben resulteert in het ontbreken van de gastheer van
Legionella. Bijkomend voordeel is dat bij het ontbreken van een volgroeide biofilm, er zich
geen voedingsbodem en beschermend milieu in het koelwatersysteem bevindt waarin de
Legionella-bacterie zich kan ontwikkelen en vandaar het koelwater kan besmetten. Er is
gestart met een dosering van 3 gr/l kalium-verbinding (als KCl), mede vanwege de
corrosieveilige situatie bij deze concentratie. Met de in het TestRig, met het koelwater van
OSF2 uitgevoerde startdosering van 3 gr/l KCl is geen significante afname van biofilmactiviteit
waargenomen. Deze biofilm-activiteit is on-line geregistreerd met een BioGeorge
monitor, ondersteund met enzymatische bepalingen op basis van ATP. Ook geven
Legionella-analyses uitgevoerd voor en na de dosering geen significante afname.
Gedurende het project is gebleken dat met regelmaat de chloorconcentratie in het koelwater
van OSF2 wordt verhoogd vanwege verhoogde Legionella-metingen. Hierdoor werd ondanks
de genomen voorzorgsmaatregelen, zoals het inbouwen van een langere verblijftijd en
verdunning, de opbouw van biofilm in het TestRig geremd en duurde het zeer lang voordat er
een biofilm was verkregen welke gebruikt kon worden om de toepassing van een kaliumverbinding
te onderzoeken. Als eerste oplossing is beluchting van het voorraadvat toegepast
om het chloor uit het water te ‘strippen’. Dit leek te helpen, echter, nog steeds bleef de
biofilm opbouw matig. Daarna is besloten om A-water van Corus te gebruiken als
suppletiewater. De spui uit het bassin van het TestRig is stopgezet, en in principe wordt
alleen verdampt water aangevuld. Om de voedingstoffen in het TestRig te behouden is
wekelijks koelwater aan het TestRig toegevoegd.
Als vervolgexperiment is een hoger kalium-gehalte gedoseerd. Uitgangspunt voor deze
dosering is dat uit onderzoek is gebleken dat een kalium-concentratie van 0,125 mol/l, wat
overeenkomt met 9,3 gr/l KCl, pinocytose activiteit in amoeben kan manifesteren. Bij deze
kalium-concentratie zal de amoebe opzwellen en onbewegelijk worden. Tevens zal het
stoppen met de opname van voedsel, waardoor het zal verhongeren en afsterven.
Toepassing van 9,3 gr/l KCl zal echter de chloride-concentratie in het koelwatersysteem van
OSF2 aanzienlijk doen toenemen en daardoor de corrosie-potentiaal, wat zou kunnen leiden
tot problemen in de procesvoering van OSF2. De vervolgexperimenten zijn daarom
uitgevoerd met kalium-diwaterstoffosfaat 17,5 gr/l wat overeenkomt met een kalium-

-35- 50452040-KPS/MEC 04-7143
concentratie van 0,128 mol/l. Het fosfaat is corrosieremmend, maar kan ook
groeibevorderend werken voor bacteriën. Met de in het TestRig, met het koelwater van
OSF2, uitgevoerde dosering van 17,5 gr/l KH 2 PO 4 is geen significante afname van biofilmactiviteit
waargenomen. Deze biofilm-activiteit is on-line geregistreerd met een BioGeorge
monitor, ondersteund met enzymatische bepalingen op basis van ATP. Ook geven
Legionella-analyses uitgevoerd voor en na de dosering geen significante afname.
Als vervolgexperiment is een kalium-verbinding gedoseerd in combinatie met een surfactant.
Uitgangspunt voor deze dosering is dat een surfactant de oppervlaktespanning van een
biofilm vermindert waardoor de doordringbaarheid van bijvoorbeeld biociden wordt verhoogd.
De toegepaste surfactant is 30 minuten voor de kalium-verbinding gedoseerd. Gedurende
deze 30 minuten Is, zoals opgegeven door de fabrikant, geen verandering in biofilm-activiteit
waargenomen die toe te schrijven is aan de werking van de surfactant, omdat deze geen
biocide-werking bezit. De experimenten zijn wederom uitgevoerd met kaliumdiwaterstoffosfaat
17,5 gr/l wat overeenkomt met een kalium-concentratie van 0,128 mol/l.
Met de in het TestRig, met het koelwater van de OSF2, uitgevoerde dosering van 17,5 gr/l
KH 2 PO 4 en surfactant is geen significante afname van biofilm-activiteit waargenomen. Deze
biofilm-activiteit is on-line geregistreerd met een BioGeorge monitor, ondersteund met
enzymatische bepalingen op basis van ATP. Ook geven Legionella-analyses uitgevoerd voor
en na de dosering van 17,5 gr/l KH 2 PO 4 geen significante afname.
Uit de resultaten van de diverse experimenten kan worden geconcludeerd dat ondanks de in
studies beschreven vermeende gevoeligheid voor kalium-ionen van amoeben en biofilm, en
aanvullend KEMA-onderzoek uitgevoerd in zoetwater, er bij de dosering van een
kaliumverbinding in het koelwatersysteem van OSF2 van Corus Strip Products te IJmuiden,
geen significante afname in biofilm-activiteit en Legionella–concentraties is waargenomen.
Ook de toepassing van een surfactant voor het ‘weekmaken’ van de biofilm, waardoor het
indringend vermogen van de kalium-ionen in de biofilm wordt geacht te worden gestimuleerd,
heeft niet geleid tot een significante afname in biofilm-activiteit.
Waarschijnlijk is de compositie van de gevormde xPS in de ontwikkelde biofilm in het brakke
met o.a. vet en olie vervuilde koelwater van OSF2 bij Corus Strip Products zo aangepast aan
dit milieu, dat de biofilm en de aanwezige Legionella-bacterien een bepaalde mate van zouttolerantie
hebben opgebouwd. Dit zou resulteren in de noodzaak van aanzienlijk hogere
kalium-concentraties ter bestrijding van de aanwezige biofilm en Legionella. Ook is het
mogelijk dat door de verontreinigingen in het koelwater de biofilm een zeer ondoordringbare
xPS heeft gevormd zodat de kalium-ionen ondanks toevoeging van een surfactant niet
kunnen binnendringen in de biofilm. Doseringen van nog hogere kalium-concentraties in

-36- 50452040-KPS/MEC 04-7143
koelwatersystemen wordt door de hoge toename van de salaniteit in het koelwater van OSF2
praktisch gezien als niet verantwoord geacht. Ter bestrijding van Legionella en biofilms in het
algemeen in het koelwater van OSF2 is het in dit geval beter over te gaan op een andere
oxidatieve of non-oxidatieve biocide.
5 AANBEVELINGEN
Legionella-problemen staan in het middelpunt van de belangstelling zowel bij de industrie als
bij de overheid. De regelgeving voor industriële watersystemen is vastgelegd in de Arbo-wet.
De toelichting op Beleidsregel 4.37 van deze wet zal eind dit jaar in de vorm van een Arbo-
Informatieblad (AI-blad) verschijnen. Voor de bestrijding van Legionella-bacteriën in
industriële koelwatersystemen wordt op dit moment in feite alleen gebruik gemaakt van het
doseren van biocides (oxidatief of non-oxidatief) met of zonder surfactanten. In het AI-blad
wordt weergegeven hoe het risico zo klein mogelijk gemaakt kan worden.
Belangrijk is dat men zich realiseert dat de bestrijding van Legionella in koelwatersystemen
als oorsprong de biofilm heeft. Deze biofilm fungeert als voedingsbron en besmet hieruit de
waterfase. Legionella in de waterfase is eenvoudig met biociden te bestrijden, echter
aanwezig in een ondoordringbare biofilm zal de Legionella ondanks een goed functionerend
biocide telkens het koelwater opnieuw infecteren. Het is dus belangrijk het biocideregime af
te stemmen op de bestrijding van biofilms, in plaats van op de bestrijding van microorganismen
in de waterfase. Bestrijding van een biofilm in plaats van planktonische microorganismen
kan resulteren in de keuze van een geheel ander soort biocide. Met name in
(open)recirculatie koelwatersystemen waarin zich veel organische componenten bevinden
zoals olie en vetten, zijn oxidatieve biociden veel minder effectief dan non-oxidatieve
biociden. Non-oxidatieve biociden mogen dan per volume-eenheid veel duurder zijn, vaak
dient men in deze systemen aanzienlijk minder product te doseren. Aanbevolen wordt om de
huidige chloorbleekloog-dosering van OSF2 bij Corus Strip Products te evalueren op de
effectiviteit van biofilm bestrijding en op de mogelijkheid van toepassing van een andere
biocide. De mogelijkheden om alternatieve biocides toe te passen zijn in Nederland zeer
beperkt in verband met milieuhygiënische bezwaren. Het gebruik van non-oxidatieve
biocides is hierdoor vrijwel uitgesloten. Voor een goede hygiëne van het koelwatersysteem
blijven adequaat technisch onderhoud en een goede waterbehandeling belangrijk voor de
preventie van Legionella-besmetting.

-37- 50452040-KPS/MEC 04-7143
LITERATUUR
BARBAREE, J.M.,1986. “Isolation of protozoa from water associated with a Legionellosis
outbreak and demonstration of intracellular multiplication of Legionella pneumophila.”, Appl.
Environmental Microbiol. 51:422-424.
BILLOT-BONEF, S., Cabanes, P.A., Marciano-Cabral, F., Pernin, P. & Pringuez, E., 2001.
”IX th International meeting on the Biology and Pathogenicity of Free-living Amoebae
Proceedings.”, Paris 8-14 July 2001.
BORENSTEIN, S.W. & Licina, G.J.,1998. “Detecting microbiologically influenced corrosion
using innovative monitoring and inspection techniques.”, Bron: Structural Integrity
Assoicates, Inc, 1998.
BROWN, M.R.W. & Gilbert, P., 1993. “Sensitivity of biofilms to antimicrobial agents.”, Appl.
Bacteriol. Symp. Suppl., 74:87S-97S.
BRUIJS, M.C.M., Venhuis, L.P., Jenner, H.A., Daniels, D.G. & Licina, G.J. 2001. “Biocide
optimization using an on-line biofilm monitor.”, Journal of Power Plant Chemistry. 3(7):400 –
405 (2001).
CHAPMAN-ANDRESSEN, C., 1962. “Studies on pinocytosis in amoebae.”, Compt.-rent.
Trav. Lab Carlsberg, Vol. 33, No.3. 73-264.
FALLON, H.P., 2004. “A performance-based approach to cooling water chemistry control.”,
PowerPlant Chemistry, April 2004, pp.203-223.
HELLER, R., Holler, C., Sußmuth, R. & Gundermann, K.O., 1998. “Effect of salt concentration
and temperature on survival of Legionella pneumophila.”, Letters in Applied
Microbiology 26:64-68.
HOLAH, J.T., 1992. “Industrial monitoring: hygiene in food processing.” In: Melo, L.F., Bott.
T.R., Fletcher, M. & Capdeville, B., (eds.) ‘Biofilm-Science and technology’. Kluwer Academic
Publications, Dordrecht, The Netherlands, pp. 645-659.
HOWLAND, E.B. & Pope, D.H., 1983. “Distribution and seasonality of Legionella pneumophila
in cooling towers.”, Current Microbiology, Vol. 9, pp. 319-324.

-38- 50452040-KPS/MEC 04-7143
JACKSON, S.M. & Jones, E.B.G., 1991. “Interactions within biofilms: the disruption of biofilm
structure by protozoa.”, Kieler Meeresforsch 8:264-268.
JANSSEN-MOMMEN, J.P.M., Wevers, M. & Bruijs., M.C.M., 2002. “Alternatieven voor
biofilm- en Legionella-bestrijding.”, KEMA-rapport.
JOHANSSON, P. & Josefsson, J-O., 1984a. “Activation of the capacity for sodium induced
pinocytosis in Amoeba proteus.”, Exp. Cell. Res. 154:376-385.
JOHANSSON, P. & Josefsson, J-O., 1984b. “Selective inhibition of calcium stimulated
cation. Induced pinocytose by starvation and inhibitors of protein synthesis in Amboeba
proteus.”, Exp. Cell. Res. 154:367-375.
KLOPOCKA, W., Balinska, M. & Kolodziejczyk, J., 2000. “Role of Extracellular calcium in the
induction of pinocytosis in Amoeba proteus by Na- and K-ions.”, Acta. Protozool. (2000)
39:143-148.
KWAIK, Y.A., Gao, L.Y., Stone, B.J., Venkataraman, C. & Harb, O.S., 1998. “Invasion of
protozoa by L. Pneumophila and its role in bacterial ecology and pathogenesis.”, Appl.
Environ. Microbiol. 64:3127-3133.
MARSHALL, K.C., 1996. “Adhesion as a strategy for access to nutrients’., In: Fletcher, M
(ed) ‘Bacterial adhesion: molecular and ecological diversity.’, Wiley, New York, pp. 59-87.
MAYER, C., Moritz, R., Kirschner, C., Borchard, W., Maibaum, R., Wingender, J. &
Flemming, H.C., 1999. “The role of intermolecular interactions: studies on model systems for
bacterial biofilms.”, International Journal of Biological Macromolecules 26:3-16.
MORTON, L.H.G., Greenway, D.L.A, Gaylarde, C.C. & Surman, S.B., 1998. “Consideration
of some implications of the resistance of biofilms to biocides.”, Int. Biodet. Biodegr. 41:247-
259.
NEN 7420 INDUSTRIEEL KOELWATER. “Bepaling van de effectiviteit van koelwaterconditioneringsprogramma’s
onder standaardomstandigheden”, Nederlands Normalisatie-
Instituut; september 1995; UDC 621.565:628.1.034:543.3.
PAGE, F.C., 1988. “A new key to freshwater and soil Gymnamoeba with instructions for
culture.”, Freshwater Association’, Natural Environment Research Council, London (1988).

-39- 50452040-KPS/MEC 04-7143
ROWBOTHAM, T.J., 1980, “Preliminary report on the pathogenicity of Legionella
pneumophila for freshwater amoebae.”, Journal of Clinical Pathology. 33:1197-1183.
VENHUIS, L.P. & Jenner, H.A., 1998a. “Monitoring van microbiële verslijming”. KEMA
rapport 1998
VENHUIS, L.P., 1998b. “Monitoring van microbiële verslijming – Eindevaluatie van het
BioGEORGE-systeem voor vermindering van biocide gebruik in koelwatersystemen.”,
KEMA-rapport, 1999.
WINGENDER, J., Neu, T.R. & Flemming, H-C, 1999. “Microbial Extracellular Polymeric
Substances: Characterization, Structure and Function.”, Springer-Verlag Berlin Heidelberg
New York ISBN 3-540-65720-7.
WOFAARDT, G.M., Lawrence, J.R., Robarts, R.D. & Caldwell D.E., 1995. “Bioaccumulation
of the herbicide diclofop in extracellular polymers and its utilization by a biofilm community
during starvation.”, Appl. Environ. Microbiol. 61:152-158.
WOLFAARDT, G.M., Lawrence, J.R., Robarts, R.D. & Caldwell, D.E., 1998. “In situ characterization
of biofilm exopolymers involved in the accumulation of chlorinated organics.”,
Microb. Ecol. 35:213-223.

-40- 50452040-KPS/MEC 04-7143
BIJLAGE A
BIOGEORGE
Het is belangrijk om een optimaal bestrijdingsregime toe te passen welke is afgestemd op
specifieke systeemcondities. Om de effectiviteit van de bestrijding, c.q. waterbehandeling te
kunnen bepalen, zal de microbiële activiteit moeten worden gemonitored. Om direct te
kunnen anticiperen op veranderingen in systeemcondities, wordt de voorkeur gegeven aan
een ‘on-line’ monitoringsysteem. De BioGeorge is zo’n ‘on-line’ monitoringsysteem.
5.1 Principe
Het BioGeorge-monitoringsysteem is ontworpen om de afzetting en activiteit van microorganismen
op metalen oppervlakten ‘on-line’ te registeren. Tevens heeft het systeem zich
bewezen als een continue bepaling van de effectiviteit van biociden. Het systeem werkt
volgens het principe dat micro-organismen invloed hebben op de ‘operatieve’ elektrochemische
halfreacties aan een metalen oppervlak. Deze invloed wordt veroorzaakt doordat
micro-organismen een scala aan chemische en fysische processen nodig hebben voor groei
en ontwikkeling.
5.2 Sensor
De BioGeorge-monitor kan in twee versies worden uitgevoerd. De ‘cilindrische’ sensor en
de ‘doorstroom’-sensor. De ‘cilindrische’ sensor wordt zijdelings in een leiding geplaatst of
onder de sproeikop van een koeltoren, terwijl de ‘doorstroom’-sensor zelf deel uit maakt van
de leiding.
5.2.1 ‘Cilindrische’ sensor
De ‘cilindrische’ monitoringsensor bestaat uit twee identieke elektroden die zijn opgebouwd
uit een aantal titanium schijven (om en om, vijf stuks per elektrode). Deze schijven worden
door een elektrisch isolerende epoxyhars onderling gescheiden en vormen samen een
cilinder. Tevens zijn de elektroden gescheiden van de roestvast stalen plug die dienst doet
als behuizing van de sensor. In figuur 4.1 is een schematische doorsnede weergegeven.

-41- 50452040-KPS/MEC 04-7143
Figuur 5.1
Schematische doorsnede en foto van ‘cilindrische’ sensor
5.3 Werking
Twee identieke elektroden die aan dezelfde omgeving zijn blootgesteld, hebben dezelfde
potentiaal. Doordat de elektroden aan elkaar verbonden zijn via een weerstand, loopt er
geen stroom. Het polarisatieschema stimuleert echter elektrochemische condities op een
dergelijke wijze waardoor afzetting en groei van biofilms wordt gestimuleerd.
Om biofilms te kunnen detecteren, wordt dagelijks gedurende één uur lang één van beide
elektroden in de sensor kathodisch gepolariseerd. Deze stroom is de applied-current (Ia).
Door het registreren van de stroom die noodzakelijk is om de gewenste potentiaal over een
bepaalde tijdsperiode te bereiken, kan de invloed van een biofilm op ‘operatieve’ halfreacties
worden gedetecteerd. Bij ontwikkeling van een biofilm op de sensor zal de stroom die
noodzakelijk is om de oorspronkelijke (begin)-polarisatiepotentiaal te bereiken, toenemen.
Tijdens de periode dat de elektrode niet wordt gepolariseerd, zijn de twee elektroden in de
sensor met elkaar verbonden door een weerstand. Tussen de elektroden ontstaat een
stroom (in µA µ = micro = 10 -6 ) door de geladen afbraakproducten van het organisch
materiaal in de biofilm. Deze stroom wordt aangegeven met de generated-current (Igen). De
afzetting van micro-organismen en de groei van biofilms wordt door het systeem continu
gemeten door de stroom in de tijd te monitoren.
Tijdens de polarisatieperiode wordt de applied-current gemeten en gedurende de periode dat
de elektroden door een weerstand met elkaar zijn verbonden, wordt de generated-current
gemeten.

-42- 50452040-KPS/MEC 04-7143
5.4 Controller
Om de microbiële activiteit op de sensor te kunnen waarnemen, is elke sensor verbonden
aan een zogenaamde controller. De controller bevat een LCD-display, drie drukknopjes (yes,
no en enter) en drie LED’s (groen, geel en rood). Van de display is de actuele meetwaarde
(Igen of Ia) af te lezen. De controller is tevens uitgerust met een simpele interface waarmee
de gebruiker parameters zoals polarisatiecyclus, datum en tijd, voltageniveaus en
alarmniveaus kan instellen. Hierdoor is geen externe pc noodzakelijk om deze functies te
kunnen uitvoeren. Een pc is alleen noodzakelijk voor het uitlezen van de meetdata zodat de
resultaten kunnen worden geanalyseerd en geïnterpreteerd.
Figuur 5.2
BioGeorge-controllers
LED’s
De drie LED’s (Light Emitting Diodes) waarmee de controller is uitgerust, geven de status
van het systeem aan. Deze LED’s zijn groen (linker LED), geel (middelste LED) en rood
(rechter LED) en operen via de volgende logica:
Groen : CONTINU AAN betekent dat de controller normaal functioneert en dat alle
operationele parameters binnen de gestelde limieten bijlven.
Geel
: CONTINU AAN houdt in dat de controller normaal functioneert, maar de
gegenereerde data is ontoereikend om de baseline-waarden te kunnen instellen,
zodat hieraan toekomstige waarden kunnen worden getoetst. Om een
representatieve baseline te kunnen opstellen, moeten minimaal drie

-43- 50452040-KPS/MEC 04-7143
polarisatiecycli zijn doorlopen. De controller blijft in deze status totdat
representatieve waarden zijn verzameld. Deze status vindt plaats wanneer het
systeem voor de eerste keer wordt opgestart of wanneer de controller is gereset.
Rood
: CONTINU AAN geeft aan dat een alarmerende situatie op de sensor is ontstaan.
Verdere monitoring en registratie van de data vindt plaats.
KNIPPEREND AAN en UIT betekent dat de controller een fout heeft
gedetecteerd. Verdere meting is niet meer mogelijk en de monitoring stopt.
Behalve tijdens het opstarten van het systeem, is gedurende een normale voorgang van het
systeem slechts één LED ‘aan’.
Foutdetectie
De controller detecteert en rapporteert de volgende foutmeldingen:
- memory fault: data kan mogelijk onbetrouwbaar zijn of de data wordt niet opgeslagen
- hardware fault: juiste werking van het systeem kan niet worden gegarandeerd
- invalid measurement: de opgeslagen stroom of voltage overschrijdt de werkingslimieten
van het systeem. Juiste werking van het systeem is niet meer gewaarborgd. Het systeem
(baseline) zal moeten worden gereset.
Alarmindicatie
De controller bevat geen functie om een audiosignaal af te geven bij een alarm. De operator
wordt gewaarschuwd via de boodschap op de LCD-display en het knipperen van de Status
LED’s (lampjes). De volgende alarmboodschappen worden weergegeven:
- I applied alarm: de baseline-berekening geeft aan de recent opgeslagen waarde de limiet
van de I applied factor overschrijdt
- I generated alarm: de baseline-berekening geeft aan dat de recent opgeslagen waarde
de limiet van de I generated offset overschrijdt
- rate of change alarm: de baseline-berekening geeft aan dat de resent opgeslagen
waarde de limiet van de Rate of change waarde overschrijdt.
5.5 Outputdata
De output van de sensor bestaat uit twee signalen. Eén signaal is het potentiaalverschil
tussen de elektrodesets. De andere is de potentiaalval wanneer de applied-current of
generated-current langs een gekalibreerde weerstand (1000 Ohm) in de controleapparatuur
wordt geleid. Uit deze twee signalen worden de applied-current en de generated-current

-44- 50452040-KPS/MEC 04-7143
berekend. De ruwe data wordt iedere 10 seconden gemeten en verzameld in een database
met tijdsintervallen van 30 seconden wanneer de polarisatie bezig is en 10 minuten wanneer
dat niet het geval is.
De gemeten data worden opgeslagen in een data-acquisitiesysteem en na het downloaden
van de data grafisch weergegeven in een zogenaamde ‘trend-plot’ met behulp van een softwareprogramma.
De trend-plot geeft de appield-current en generated-current in de tijd weer.
Tevens wordt het rekenkundig verschil tussen applied-current en generated-current berekend
(Ia-Igen). Dit wordt gedaan omdat bij sommige toepassingen de generated-current
een tegengestelde waarde bezit dan de applied-current. Het rekenkundig verschil tussen de
twee stromen is in deze situatie een geschikte indicatie voor de toename van biofilm activiteit
(Borenstein & Licina, 1998).
De software behorende bij het BioGeorge-systeem is een Microsoft Excel-macro, hiermee
kan het uitgelezen tekstbestand afkomstig van de controller wordt omgevormd tot een
spreadsheet. Deze spreadsheet geeft de aanwezigheid van een biofilm met behulp van een
statuslijn in de grafiek weer.
5.6 Detectie van microbiële verslijming
Voorafgaande aan de vorming van een biofilm kunnen stromen in de orde van 1µA tot 10µA
worden verwacht tijdens de polarisatie van de elektrode. Bij vorming van een biofilm op de
elektrode zal de stroom die noodzakelijk is op de oorspronkelijke (begin)-polarisatie te
bereiken, toenemen. Deze duidelijke toename wordt vergeleken met de trend van de
applied-current, berekend over een aantal voorafgaand geregistreerde waarden. Vorming
van een biofilm zal de generated-current, die stabiel en nagenoeg 0 bedraagt voorafgaande
aan de vorming van een biofilm, veranderen tot waarden van 1/10 tot ½ van de waarde van
de applied-current.
Mechanische of chemische verwijdering van de biofilm van de monitoringsprobe zal de
applied-current terug naar zijn oorspronkelijke waarde doen gaan en de waarde van de
generated-current doen verdwijnen (Borenstein & Licina, 1998). Toename in de afwijking van
applied-current (Ia) of generated-current (Igen) van de basislijn waarden, levert een indicatie
voor de afzetting en toename van biofilm activiteit. Effectieve biofilm bestrijding resulteert in
een verandering van de applied-current en generated-current naar hun oorspronkelijke
waarde.

-45- 50452040-KPS/MEC 04-7143
BIJLAGE B
ENZYMATISCHE BEPALING VAN MICROBIËLE ACTIVITEIT
Bepaling van microbiële activiteit m.b.v. Adinosine-5’-Tri-Phosphaat (ATP)
Het gehalte aan microbieel ATP kan worden bepaald met de Microbial Biomass Test Kit van
leverancier Celsis Lumac. Hiermee wordt het gehalte aan vrij en totaal ATP in een waterfase
gemeten waarna de microbiële activiteit wordt afgeleid door het verschil in waarden van vrij
ATP en totaal ATP. De test maakt gebruik van bioluminescentie meting (licht emmisie) dat
geregistreerd wordt met een spectrofotometer. Vrij ATP is afkomstig van dode microorganismen
en is vrij in de waterfase aanwezig. Totaal ATP is het gehalte dat gemeten wordt
na toevoeging van een nucleotide (NRM-medium) die de micro-organismen dood, waardoor
het ATP uit de micro-organismen vrij in de waterfase komt samen met het al aanwezige vrije
ATP. De uitvoering van de test wordt onderstaand puntgewijs aangegeven:
1. reagentia: aanwezig in de test kit is gevriesdroogde luciferaze-enzym (Lumit-QM), buffer
(Lumit-QM Diluent) en nucleotide-oplossing (NRM). Voor aanvang van de test wordt het
Lumit-QM Diluent geheel (3 ml) toegevoegd aan het Lumit-QM en opgelost.
2. bepaling vrij ATP: ter bepaling van vrij ATP wordt 100 µL watermonster overgebracht in
een Lummacuvette,waarna direct 100 µL Lumit-QM wordt toegevoegd. Laat gedurende
10 seconden reageren onder intensief schudden, hiervoor kan de vortex op de
spectrofotometer worden gebruikt (Biocounter).Hierna wordt de lichtemmissie gemeten
3. bepaling totaal ATP: ter bepaling van vrij ATP wordt 100 µL watermonster overgebracht
in een Lummacuvette, waarna direct 100 µL NRM-oplossing wordt toegevoegd. Laat
gedurende 10 seconden reageren onder intensief schudden en voeg daarna 100 µL
Lumit-QM toe. Deze oplossing tevens gedurende 10 seconden laten reageren onder
intensief schudden, waarna de lichtemmissie wordt gemeten
4. resultaat: het verschil in waarden van totaal ATP en vrij ATP is het microbieel ATP. Deze
waarde moet positief of nul zijn en wordt uitgedrukt in Relatieve Licht Units (RLU). RLU is
een maat voor een hoeveelheid uitgezonden licht, deze lichthoeveelheid heeft een vaste
verhouding met de hoeveelheid ATP in het monster namelijk: 1 picogram ATP/mL = 7.2
RLU. De gevonden microbiële activiteit kan worden uitgedrukt in ATP/ml of, waaraan ik
de voorkeur geeft, RLU/ml koelwater.