Jaarboek no. 87. 2008/2009 - Koninklijke Maatschappij voor ...

Diligentia 79
de zebravis al tijdens de embryogenese tot expressie komen [18]. Bovendien blijkt de expressie
van sommige TLRs induceerbaar te zijn door bacteriële infecties [17].
Om aan te tonen dat de TLR-signaalroute al in het zebravisembryo actief is hebben wij
gebruik gemaakt van de hierboven beschreven morpholino-knockdown-techniek. Allereerst
hebben wij een morpholino gericht tegen MyD88. Dit is een essentieel adaptermolecuul
in de signaaltransductie van bijna alle TLRs. In tegenstelling tot de controlegroep, waren
embryo’s die geïnjecteerd waren met de MyD88-morpholino niet meer in staat om een
niet-pathogene bacteriële infectie op te ruimen. Dit experiment toont dus aan dat MyD88
noodzakelijk is voor de immuunrespons van zebravisembryo’s. Recente morpholino-knockdown-studies
in zebravisembryo’s (ongepubliceerde data) hebben tevens laten zien dat de
zebravishomologen van TLR5 (Tlr5a en b) betrokken zijn bij de herkenning van bacterieel
flagelline, evenals TLR5 van de mens. Deze resultaten onderstrepen de bruikbaarheid van
het zebravisembryomodel voor onderzoek naar de signaalroutes van het aangeboren immuunsysteem.
Transgene zebravislijnen voor immunologisch onderzoek
De transparantie van zebravisembryo’s maakt het mogelijk om de ontwikkeling en het
gedrag van immuuncellen zichtbaar te maken in een levend organisme, zonder gebruik
van invasieve technieken [11]. Dit kan met behulp van contrastmicroscopie of met behulp
van fluorescentiemicroscopie wanneer gebruik wordt gemaakt van transgene zebravissen
(figuur 4). In de laatste jaren zijn verschillende zebravislijnen met fluorescent-gemarkeerde
immuuncellen ontwikkeld. Bijvoorbeeld de PU.1-GFP-lijn vertoont specifieke fluorescentie
in de vroege precursors van de macrofagen en neutrofielen in 1-dag oude embryo’s [19].
Daarnaast zijn er transgene lijnen waarin de neutrofielen of een subpopulatie daarvan
fluorescent gemarkeerd zijn [20-22]. Met behulp van deze lijnen kan het proces van acute
inflammatie dat optreedt als reactie op een weefseltrauma in detail worden gevolgd, evenals
de resolutiefase waarin de ontstekingsreactie weer wordt opgeheven. Onderzoek van verschillende
groepen heeft aangetoond dat de inflammatie van een verwond embryoweefsel
na 12 tot 24 uur weer is opgelost en dat bij de resolutiefase twee processen een rol spelen:
de geprogrammeerde celdood (apoptose) van neutrofielen en de migratie van neutrofielen
terug naar het bloedvatstelsel van het embryo [20,21]. Een macrofaag-specifieke transgene
lijn bestaat nog niet, maar wij hebben recent nieuwe macrofaag-specifieke genen gekarakteriseerd,
waarvan de promotors nu gebruikt kunnen worden voor koppeling aan GFP en het
genereren van een transgene lijn. Zolang een dergelijke lijn nog niet beschikbaar is, kunnen
macrofagen wel eenvoudig zichtbaar gemaakt worden door injectie van fluorescente bacteriën
of fluorescente micro-beads. Omdat macrofagen efficiënte fagocyten zijn, raken ze
hierdoor snel fluorescent gelabeld, terwijl de neutrofielen in zebravisembryo’s slechts een
geringe fagocytose-activiteit hebben [22, 23].
Figuur 4. Visualisatie van immuuncellen in zebravisembryo’s door middel van
contrastmicroscopie (A) of fluorescentiemicroscopie (B). (A) Macrofaag (links) en drie rode
bloedcellen in een bloedvat dat over de dooierzak van een 1-dag-oud embryo loopt. (B)
Transgene zebravis met GFP-expressie in het oog en in neutrofielen in de staart van een
3-dagen-oud embryo [22]. De inzet in B toont een detail van de GFP-gelabelde neutrofielen.
De lengtemaat is 10 micrometer.
Zebravissen bij het ontrafelen van het immuunsysteem