Jaarboek no. 87. 2008/2009 - Koninklijke Maatschappij voor ...

Diligentia 75
worden. De meest gebruikte mutagenese-methode is chemische mutagenese met N-ethyl-
N-nitroso-urea (ENU). ENU induceert over het algemeen puntmutaties door overdracht
van de ethylgroep naar individuele basen van het DNA, waardoor fouten bij de replicatie
ontstaan. Hoewel ENU-mutagenese zeer efficiënt is, is de kartering van puntmutaties in het
genoom bewerkelijk en kan de positionele klonering van een gemuteerd gen een langdurig
proces zijn. De opsporing van mutaties is eenvoudiger wanneer een insertionele mutagenesemethode
wordt toegepast, bijvoorbeeld met behulp van transposons or retrovirale
vectoren. Deze kunnen vervolgens als startpunt dienen voor het sequencen van het gemuteerde
gen. De frequentie van insertionele mutagenese is echter een veelvoud lager dan de
frequentie van ENU-mutagenese. De eerste grootschalige ENU-mutagenese-screeningen
in het begin van de jaren negentig hebben geleid tot de karakterisering van honderden
mutaties betrokken bij de patroonvorming van het embryo en bij de ontwikkeling van cellen
en organen [5,6]. Dit werk heeft de zebravis definitief als diermodel op de kaart gezet.
Knockout-technieken
De functie van enkele tientallen procenten van alle genen van de mens en andere gewervelde
organismen is nog volledig onbekend. Een krachtige manier om genfuncties te
onderzoeken is de specifieke uitschakeling van een gen met behulp van een knockoutmethode
(‘reverse genetics’). Voor de laboratoriummuis is een knockout-methode beschikbaar
die gebaseerd is op homologe recombinatie in embryonale stamcellen. Helaas is deze
methode nog niet succesvol toegepast in de zebravis. Echter, TILLING (targeting induced
local lesions in genomes) vormt een bruikbaar alternatief [7]. Hierbij worden, net als bij de
hierboven genoemde mutagenese-screeningen, willekeurige mutaties in het genoom aangebracht
en wordt vervolgens gericht gezocht naar mutaties die een stopcodon introduceren
in het gen van interesse. Oorspronkelijk werd voor de opsporing van deze mutaties een
techniek toegepast die gebaseerd is op de herkenning van mismatch-hybridisaties. Gezien
de enorme toename van de efficiëntie van DNA-sequencing, is grootschalige sequentieanalyse
tegenwoordig de meest toegepaste methode voor de opsporing van knockout-mutaties.
Morpholino-knockdown
Naast het maken van knockout-mutanten zijn er ook methoden ontwikkeld om genfuncties
tijdelijk en/of gedeeltelijk uit te schakelen (‘knockdown’). In celculturen en andere
diermodellen zoals Caenorhabditis elegans is RNA-interferentie (RNAi) een veel toegepaste
techniek. Bij RNAi wordt een RNA-sequentie geïntroduceerd die complementair is aan het
uit te schakelen mRNA. Hierdoor wordt een dubbelstrengs RNA gevormd, dat herkend en
afgebroken wordt door het enzym Dicer. De resultaten met RNAi in zebravisembryo’s zijn
niet eenduidig, maar een goed en uitvoerig toegepast alternatief is het gebruik van morpholino’s
[8]. Morpholino’s zijn korte synthetische oligonucleotiden (over het algemeen 25
basen lang) waarvan de chemische structuur resistent is tegen afbraak door nucleases. De
sequentie van een morpholino wordt zo ontworpen dat deze complementair is aan de sequentie
rond het startcodon van het gen van interesse of aan de sequentie rond een intronsplicingsplaats.
Wanneer een morpholino vervolgens geïnjecteerd wordt in een ééncellig
embryo blokkeert het de translatie of de splicing van het betreffende mRNA. Het effect op
het fenotype van het embryo kan beïnvloed worden door de dosis van de morpholino te
variëren. De werkingsduur van morpholino’s verschilt van één dag tot maximaal acht dagen.
Sommige morpholino’s vertonen toxische bijwerkingen of hebben een onbedoeld effect op
een ander gen. Daarom is het van groot belang is om goede controles op de specificiteit
uit te voeren. Desalniettemin is de morpholino-knockdown-techniek een zeer snelle en
effectieve methode om genfuncties te onderzoeken. Een belangrijk voordeel is bovendien
dat door combinatie van morpholino’s ook verschillende genen tegelijkertijd uitgeschakeld
kunnen worden.
Genetische modificatie
Transgenese (het inbrengen van soortvreemd DNA) en cisgenese (het inbrengen van soort-
Zebravissen bij het ontrafelen van het immuunsysteem