Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

Gegevens en rekenvoorbeelden
Het molecuulgewicht van IgG =
150 kDa en dat van GFP 26.9 kDa.
IgG 5 mg/mL
5 (g/L) / 150 000 (g/mol) = 33.33
x 10 -6 mol/L = 33.33 µM. Deze
concentratie bevat 66.66 µM bindingsplaatsen
voor een antigeen.
Voor GFP geldt eenzelfde berekening.
5 mg/mL = 5 (g/L) / 269 00
(g/mol) = 185.9 µM
1 µg IgG kan maximaal 13.3 pmol
antigeen binden. De berekening
is alsvogt. Ga uit van 5 µg IgG/µL.
Dit is 33.33 µM. 1 µg bevat dan
33.33/5 x 10 -6 µmol = 6.67 x 10 -
12 mol = 6.67 pmol. Het aantal
bindingsplaatsen is dan twee
maal zo groot, 13.33 pmol.
Voor GFP is de berekening
gelijk. 1 µg GFP = 37.2 pmol GFP
(185.9/5 = 37.2).
De ratio van complexvorming
tussen IgG en GFP op basis van
µg is: IgG (µg) / GFP (µg) = 1/2.79
(mol/mol)
a) Het karakteriseren van het antilichaampreparaat (IgG preparaat)
Om een immunoprecipitatie uit te kunnen voeren is er een antilichaampreparaat
nodig met een voldoende hoge antigeenbindingsaffiniteit en concentratie
van de reagerende IgG moleculen. Dit betekent dat het percentage
IgG moleculen met een hoge bindingsaffiniteit voor het antigeen hoog moet
zijn. Bij voorkeur meer dan 20%. Dit is de eerste vereiste voor een succesvolle
immunoprecpitatie.
In deze simulatie worden antilichamen gebruikt tegen GFP. GFP staat voor
Green Fluorescent Protein. Dit eiwit heeft een zeer hoge fluorescentie en is
hierdoor eenvoudig met fluorescentie te detecteren.
Het protocol voor de bereiding van een goed gedefinieerd antilichaampreparaat
is als volgt. Men immuniseert een konijn met GFP. Men tapt bloed af
en uit het serum wordt de IgG fractie gezuiverd. Deze wordt getest op de
concentratie en affiniteit van de bindende IgG’s. De concentratie en ‘bruikbare’
affiniteit kan eenvoudig worden getetst door te bepalen welke het percentage
reagerende IgG moleculen is nadat het protocol met precipitatie en
wasstappen doorlopen is. Als de bindingsaffineit voldoende is dan zal men
niet te veel antigeen te verliezen tijdens de wasstappen (= het verwijderen
van niet-specifiek gebonden eiwitten).
Protocol voor een immuunreactie tussen GFP en IgG.
In een Eppendorf reactievaatje wordt buffer gemengd met 5 µL gezuiverd
GFP (1 µg/mL bijvoorbeeld) en 20 µL van een verdunde IgG oplossing (50
µg/mL). In opeenvolgende incubaties wordt de concentratie GFP steeds
meer opgevoerd. Na een reactie van 1 uur worden aan de incubatie agarose
bolletjes toegevoegd. Deze bolletjes zijn voorzien van Protein A. Dit eiwit
bindt aan het Fc-gedeelte van IgG moleculen. Er kan maximaal 1 µg IgG per
incubatie gebonden worden. Na een reactietijd van 1 uur worden agarose
bolletjes met de gebonden IgG-GFP moleculen afgedraaid en wordt de
concentratie van (het niet-gebonden) GFP in het supernatant met behulp
van fluorescentie correlation spectroscopie (FCS) gemeten. Een concentratie
1 pg/mL GFP kan nog gemeten worden. Tot een concentratie van 10 μg/mL
is het fluorescentiesignaal rechtevenredig met de concentratie. Voor deze
metingen is slechts 200 µL oplossing vereist.
Met behulp van deze technieken is het mogelijk de bindingscapaciteit van
het IgG preparaat voor GFP moleculen te bepalen. De bindingscapaciteit
moet worden uitgedrukt in een mol-ratio: hoeveel mol GFP kan per mol IgG
gebonden worden. Vervolgens kan worden berekend hoeveel procent van
de IgG moleculen reageert met GFP.
Gegevens nodig voor het schrijven van het verslag
Gebruik het progress report dat in het programma gemaakt wordt om in het
verslag aan te geven hoe je het IgG preparaat hebt gekarakteriseerd en of de
kwaliteit voldoende is gebleken om het preparaat te gebruiken voor een immunoprecipitatie
van een eiwitcomplex. Voor de berekeningen zijn de molecuulgewichten
van GFP en IgG van belang. Deze zijn 26.9 kDa en 150 kDa
respectivelijk. Een oplossing van 5 mg/mL GFP bevat 185.9 μM GFP. Realiseer
je dat IgG 2 bindingsplaatsen voor een antigeen heeft. Een oplossing van 5
mg/mL kan dus 66.67 μM antigeen binden.
b) Protocol voor een immunoprecipitatie
In een serie genetische experimenten is getracht C-terminaal van alle ei-
- -