Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

Samenvatting van het experiment
1) Het karakteriseren van een te gebruiken IgG preparaat en het koppelen
van IgG moleculen aan agarose beads.
2) Precipiteren van een antigeencomplex met IgG-agarose beads. Niet-specifiek
gebonden eiwitten via wasstappen verwijderen.
3) Loskoppelen van een antigeencomplex van IgG-agarose beads met behulp
van SDS.
4) Het gezuiverde complex scheiden in polypeptideketens via SDS-PAGE.
5) Individuele banden uit een SDS-gel snijden, disulfidebindingen reduceren,
de S-H groepen carboxymethyleren en de polypetideketen splitsen
met trypsine.
6) De massa van de trypsinefragmenten bepalen met MALDI-TOF.
7) Het vergelijken van de massa’s van de peptides met een peptidedatabase.
Eiwitten in de database zijn in silico geknipt en de massa van de peptidefragmenten
is berekend. Het te identificeren trypsinedigest wordt
vergeleken met alle trypsinedigesties uit de database. Na een statistische
analyse worden mogelijke overeenkomsten in een resultaattabel samengevat.
8) Na het identificeren van alle bandjes uit de SDS gel is het mogelijk na te
gaan welke polypeptideketens in het eiwitcomplex geprecipiteerd zijn en
mogelijk een structureel complex in de cel vormen.
Bovenstaande stappen moeten via de drie hoofdmenuitems in het programma
‘Immunoprecipitatie en Proteomics ‘ worden uitgevoerd. De hoofdmenuitems
zijn:
a) Het karakteriseren van het IgG preparaat (‘Characterization IgG’).
b) Het uitvoeren van een immunoprecipitatie en het bereiden van een trypsine
digestie (‘Isolation of Protein Complex’).
c) Het karakteriseren van het trypsine-digest met behulp van massaspectrometrie
en een databasezoekactie (‘Characterization of Peptides’).
Na het karakeriseren van het IgG preparaat wordt besloten of de concentratie
werkzame IgG moleculen hoog genoeg is om een succesvolle immunoprecipitatie
uit te kunnen voeren. Wanneer deze lager is dan 1% dan zal
er een nieuw preparaat moeten worden getest. Door een te lage werkzame
concentratie IgG moleculen moet er voor de immunoprecipitatie meer agarose
worden toegevoegd. Dit verhoogt de niet-specifieke adsorptie aan de
agarose zelf en ook de kans dat er eiwitten worden gebonden aan de nietspecifieke
IgG moleculen. Deze niet-specifieke co-precipitatie vertroebelt
de uitkomst van het experiment en kan zelfs een geheel onjuist antwoord
geven.
Wanneer de concentratie werkzame IgG moleculen groter is dan 1% kan
verder gegaan worden in het programma. Aan het eind van het experiment
moet je in staat zijn aan te kunnen geven welk complex er geprecipiteerd is.
Daarna wordt aangegeven uit welke componenten het compelx bestaat.
De uit te voeren activiteiten
In het programma ‘Immunoprecipitation and proteomics’ moeten, na het
openen van het startmenu waarbij een serum wordt toegewezen, drie
hoofdactiviteiten worden uitgevoerd.
- -