Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry
Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry
terwijl voor de andere onderdelen wel een voldoende is gehaald, wordt een 5 als eindresultaat doorgegeven. Wanneer voor één van de toetsen een cijfer lager dan 4.5 wordt gehaald, terwijl voor de andere onderdelen wel een voldoende is gehaald, wordt dit cijfer als eindresultaat voor het vak doorgegeven. Indien voor beide toetsen een cijfer lager dan 4.5 wordt behaald, terwijl voor de andere onderdelen wel een voldoende is gehaald, wordt het gewogen gemiddelde van beide toetsen doorgegeven. De resultaten behaald voor de verschillende onderdelen zijn terug te vinden op de blackboard site van deze cursus en op het prikbord bij Biochemie. Orde, netheid en aanwezigheid Om een groep mensen in een beperkte ruimte goed te kunnen laten werken, zal er enige discipline moeten heersen. Dit is vooral belangrijk wanneer er nauwkeurig moet worden gewerkt, zoals op dit practicum. Er wordt van je verwacht dat alle flessen, buizen met oplossingen en incubaties worden voorzien van een opschrift. Cuvetten en Eppendorf reactievaatjes horen thuis in hun respectievelijke houders. Schone pipettipjes worden altijd in bak bewaard en nooit los op tafel neergelegd. Opgeloste giftige chemicaliën worden niet door de gootsteen weggegooid maar in afvalvaten opgeslagen. Gebruikt glaswerk wordt met water omgespoeld en in de afwasbakken neergezet. Gemorst water of gemorste oplossingen worden onmiddellijk met papier opgenomen. Kledingstukken, tassen en overtollig papier worden niet op de werktafels of op de grond neergelegd. Wanneer je klaar bent met het experimentele werk wordt de werkplek opgeruimd. In verband met de giftigheid van sommige chemicaliën kan eten en drinken tijdens het werk aan de laboratoriumtafels niet worden toegestaan. De colleges beginnen om 13.30 uur en op alle andere dagen wordt je geacht ‘s middags voor 13.30 uur op de practicumzaal aanwezig te zijn. Wanneer je verhinderd bent, wordt van je verwacht dat je je afmeldt bij het secretariaat van de leerstoelgroepgroep, tel: 0317-482868. In overleg met de practicumleiding wordt bepaald wanneer je de experimenten inhaalt. Indeling van de experimenten Het practicum is onderverdeeld in drie blokken. De eerste en tweede dag zijn er college’s. Op de tweede dag, na het college wordt op de practicumzaal door de assistent een inleiding over de komende experimenten gegeven. Op de derde middag wordt er met het experimenteel werk begonnen. Er zijn gedurende het practicum twee middagen geroosterd die gebruikt kunnen worden om experimenten in te halen, om experimenten uit te werken en om verslagen te schrijven. Blok 1: in silico experimenten Immunoprecipitatie, ELISA en β-glucuronidase Blok 2: Gebruik van (spectroscopische) technieken om biochemische systemen te bestuderen (In vivo) Fluorescentie Lactaat dehydrogenase Blok 3: Kwantitatieve analyses met behulp van enzymen Urinezuurbepaling Klinische enzymactiviteitsmetingen Isoelectrisch focusseren - -
GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMENTEN VAN BLOK 1 Blok 1 bevat oefeningen in technieken waarmee eiwitten, eiwitcomplexen en enzymen kunnen worden aangetoond en gekarakteriseerd. De technieken zijn een immunoprecipitatie gevolgd door een identificatie van de geprecipiteerde polypeptiden (Immunoprecipitatie en proteomics), een ‘Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay’, ELISA (het bepalen van een hormoonconcentratie) en het bepalen van de specifieke activiteit van een enzym in een celextract (βglucuronidase als reporterenzym voor genexpressie). Bij de drie experimenten in dit blok is de apparatuur vervangen door een computerprogramma. Dit wil zeggen dat het computerprogramma moet worden voorzien van invoer (het vullen van een cuvet, ‘epje’ of ELISA plaat), vervolgens genereert het programma data die moeten worden verwerkt op dezelfde manier alsof er van een normaal apparaat gebruik werd gemaakt. De computerprogramma’s behoeden je niet voor fouten. Er geldt dus ‘rubbish in, rubbish out’. Inleiding: immunologie levert technieken om eiwitten te onderzoeken Immunologische methoden zijn belangrijk gereedschappen om eiwitten te zuiveren, kwantitatief te bepalen en te lokaliseren in de cel. Alle technieken maken gebruik van de specificiteit van antilichamen voor hun doelmoleculen. Een antilichaam (wordt ook immunoglobuline, IgG, genoemd) is een eiwit dat in een dier wordt gemaakt in een reactie op de aanwezigheid van een lichaamsvreemde stof, het antigeen. Dit kunnen eiwitten, koolhydraten en nucleinezuren zijn. Een antilichaam herkent (= bindt sterk aan) een groep of een cluster van aminozuurzijketens van het antigeen. De bindingsplaats wordt epitoop genoemd. Door de mogelijkheid van automatiseren wordt bijvoorbeeld de ELISA techniek grootschalig toegepast. Enige voorbeelden van de toepassing van ELISAbepalingen in de klinische biochemie zijn het bepalen van de bloedgroepfactor of een kwantitatieve insuline of oestrogeen bepaling. Het aantonen van de veroorzakers van infectieziekten zoals het rode hondvirus, salmonella bacteriën, schimmels zoals Aspergillus en parasieten zoals trypanosomen. De meest bekende ELISA toepassing is momenteel wel het aantonen van het AIDS veroorzakende retrovirus, Human Immunodeficiency Virus, (HIV) in bloedcellen. Het HIV virus heeft manteleiwitten die uniek zijn voor dit virus en niet in andere humane retrovirussen wordt aangetroffen. Antilichamen die zijn opgewekt tegen de manteleiwitten worden gebruikt om een besmetting met het virus aan te tonen. Het gebruik van antilichamen bij de detectie van eiwitten is op college behandeld en achtergrondinformatie is terug te vinden in Biochemistry, Berg et al. 6 de editie hoofdstuk 3.3 ‘Immunology provides important techniques with which to investigate proteins’, p. 84– 90; 5 de druk 4.3: p. 98-103. Immunoprecipitatie en proteomics Doel van het experiment Het doel van het experiment is via een simulatieprogramma inzicht te krijgen in de procedures waarmee men een immunoprecipitatie uitvoert en op welke manier het geprecipiteerde complex wordt gekarakteriseerd. Dit gaat met behulp van electroforese, massaspectrometrie en een databasezoekactie. - -
- Page 1 and 2: Basispracticum Biologische Chemie B
- Page 3 and 4: INHOUD In de colleges wordt de theo
- Page 5: ent het experiment foutloos uit te
- Page 9 and 10: Gegevens en rekenvoorbeelden Het mo
- Page 11 and 12: worden gebracht. Een methode is de
- Page 13 and 14: Vuistregels Begin met het gebruiken
- Page 15 and 16: De reactievergelijking is: MUG + H
- Page 17 and 18: Meten onder v MAX condities De Mich
- Page 19 and 20: Figuur 2.1 Quantum-mechanische voor
- Page 21 and 22: Het restant licht valt op de fotomu
- Page 23 and 24: Figuur 2.3 Een schematische voorste
- Page 25 and 26: tage van de intensiteit van de lich
- Page 27 and 28: Figuur 2.5 Links staat het absorpti
- Page 29 and 30: wordt het signaal dat afkomstig is
- Page 31 and 32: het sequencen van DNA de aminozuurv
- Page 33 and 34: Tabel 2.1 Effect van plaatsgerichte
- Page 35 and 36: • Meet de absorptie gedurende ong
- Page 37 and 38: Computer gegenereerde getallen (mL
- Page 39 and 40: Gebruik voor de berekening van de d
- Page 41 and 42: - Het werken met het Control panel:
- Page 43 and 44: OPDRACHTEN EN VRAGEN CG EXPERIMENT
- Page 45 and 46: Figuur 2.8 De overgangstoestand voo
- Page 47 and 48: Figuur 3.1 Kristallen van natriumur
- Page 49 and 50: Figuur 3.4 De electrode reacties va
- Page 51 and 52: Figuur 3.7 Structuur van acetylacet
- Page 53 and 54: een verhoging van de GOT activiteit
- Page 55 and 56: den worden. Dit is als volgt in te
GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMENTEN VAN BLOK 1<br />
Blok 1 bevat oefeningen in technieken waarmee eiwitten, eiwitcomplexen en<br />
enzymen kunnen worden aangetoond en gekarakteriseerd. De technieken<br />
zijn een immunoprecipitatie gevolgd door een identificatie van de geprecipiteerde<br />
polypeptiden (Immunoprecipitatie en proteomics), een ‘Enzyme-Linked<br />
ImmunoSorbent Assay’, ELISA (het bepalen van een hormoonconcentratie) en<br />
het bepalen van de specifieke activiteit van een enzym in een celextract (βglucuronidase<br />
als reporterenzym voor genexpressie). Bij de drie experimenten<br />
in dit blok is de apparatuur vervangen door een computerprogramma. Dit wil<br />
zeggen dat het computerprogramma moet worden voorzien van invoer (het<br />
vullen van een cuvet, ‘epje’ of ELISA plaat), vervolgens genereert het programma<br />
data die moeten worden verwerkt op dezelfde manier alsof er van een normaal<br />
apparaat gebruik werd gemaakt. De computerprogramma’s behoeden je<br />
niet voor fouten. Er geldt dus ‘rubbish in, rubbish out’.<br />
Inleiding: immunologie levert technieken om eiwitten te onderzoeken<br />
Immunologische methoden zijn belangrijk gereedschappen om eiwitten te<br />
zuiveren, kwantitatief te bepalen en te lokaliseren in de cel. Alle technieken<br />
maken gebruik van de specificiteit van antilichamen voor hun doelmoleculen.<br />
Een antilichaam (wordt ook immunoglobuline, IgG, genoemd) is een eiwit<br />
dat in een dier wordt gemaakt in een reactie op de aanwezigheid van een<br />
lichaamsvreemde stof, het antigeen. Dit kunnen eiwitten, koolhydraten en<br />
nucleinezuren zijn. Een antilichaam herkent (= bindt sterk aan) een groep of<br />
een cluster van aminozuurzijketens van het antigeen. De bindingsplaats wordt<br />
epitoop genoemd.<br />
Door de mogelijkheid van automatiseren wordt bijvoorbeeld de ELISA techniek<br />
grootschalig toegepast. Enige voorbeelden van de toepassing van ELISAbepalingen<br />
in de klinische biochemie zijn het bepalen van de bloedgroepfactor<br />
of een kwantitatieve insuline of oestrogeen bepaling. Het aantonen van de<br />
veroorzakers van infectieziekten zoals het rode hondvirus, salmonella bacteriën,<br />
schimmels zoals Aspergillus en parasieten zoals trypanosomen.<br />
De meest bekende ELISA toepassing is momenteel wel het aantonen van<br />
het AIDS veroorzakende retrovirus, Human Immunodeficiency Virus, (HIV) in<br />
bloedcellen. Het HIV virus heeft manteleiwitten die uniek zijn voor dit virus<br />
en niet in andere humane retrovirussen wordt aangetroffen. Antilichamen die<br />
zijn opgewekt tegen de manteleiwitten worden gebruikt om een besmetting<br />
met het virus aan te tonen. Het gebruik van antilichamen bij de detectie van<br />
eiwitten is op college behandeld en achtergrondinformatie is terug te vinden<br />
in <strong>Biochemistry</strong>, Berg et al. 6 de editie hoofdstuk 3.3 ‘Immunology provides<br />
important techniques with which to investigate proteins’, p. 84– 90; 5 de druk<br />
4.3: p. 98-103.<br />
Immunoprecipitatie en proteomics<br />
Doel van het experiment<br />
Het doel van het experiment is via een simulatieprogramma inzicht te krijgen<br />
in de procedures waarmee men een immunoprecipitatie uitvoert en op welke<br />
manier het geprecipiteerde complex wordt gekarakteriseerd. Dit gaat met<br />
behulp van electroforese, massaspectrometrie en een databasezoekactie.<br />
- -
Change language