Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry
Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry
Monoclonale en polyclonale antilichamen • Het antigeen bevat delen (epitoop) waaraan de antilichamen (IgG’s) binden. • Een polyclonaal antilichaampreparaat bevat meerdere verschillende IgG moleculen die elk aan verschillende epitopen binden. • Een monoclonaal antilichaam preparaat bevat identieke IgG moleculen. • De bindingsaffiniteit aan een epitoop verschilt per IgG molecuul. Het karakteriseren van de bindingsaffiniteit [ Ag] x[ Ab] Ag-Ab Ag + Ab KD = [ Ag− Ab] • K D = dissociatie constante, wordt gebruikt om de bindingsaffiniteit te karakteriseren. Een lage K D, geeft aan dat het ligand een hoge bindingsaffiniteit heeft voor het eiwit. • K D varieert tussen 10 -12 en 10 -8 M • Als 50 % van de bindingsites bezet is ([Ab] ~ [Ag-Ab]) dan is vrij [Ag] gelijk aan de K D, dus tussen 10 -12 en 10 -8 M Ag = antigeen (GFP) Ab = antibody = IgG Immunoprecipitatie methode Ag Ab Ag Ab (protein A) (protein A) beads beads ELISA methode Avidine-enzym Ag Ag-biotine Ab Ab polystryreen Gelabeld antigeen wordt verdrongen van een beperkte aantal bindingsplaatsen door ongelabeld antigeen. De bindingsplaatsen zijn gekoppeld aan een vaste drager. PowerPoint paginanummer 2
Immunoprecipitatie en proteomics Stap 1: bepaal het percentage (titer) GFP bindende IgG moleculen van een IgG preparaat • incubeer een oplopende concentratie GFP met een vaste hoeveelheid IgG. • verwijder IgG uit de oplossing • meet de in het supernatant achterblijvende concentratie GFP met behulp van fluorescentie Experimentele restricties • Altijd IgG dat geen antigeen bindt. Titer varieert, maar moet beter zijn dan 1%. • IgG wordt via protein A aan agarose-bolletjes gekoppeld die vervolgens mbv een centrifuge worden afgedraaid. Beperkte bindingscapaciteit via protein A. 1 µg IgG kan per incubatie worden gebonden. Immunoprecipitatie en peptide identificatie • Mbv een goed IgG preparaat wordt een GFP-getagd complex geprecipiteerd • Ontkoppel complex van IgG en scheidt de peptiden m.b.v SDS-PAGE • Extraheer een bandje uit de SDS gel en knip de polypeptideketen met trypsine • Bepaal de massa van de trypsinefragmenten met behulp van MALDI-TOF massa spectrometrie • Vergelijk de dataset van de massa’s met databases en identificeer de polypeptide keten en vervolgens het geprecipiteerde eiwitcomplex HRP SA A B A A Elisa test HRP SA A B HRP SA A B A B Y Y Y Y Y polystyreen Y= IgG; A = antigeen; B = biotine; SA = strepavidine • Variabele titer IgG per experiment. HRP SA •Verdringing van gelabeld antigeen door ongelabeld antigeen •Label wordt via een enzymactiviteitsmeting zichtbaar gemaakt PowerPoint paginanummer 3
- Page 11 and 12: worden gebracht. Een methode is de
- Page 13 and 14: Vuistregels Begin met het gebruiken
- Page 15 and 16: De reactievergelijking is: MUG + H
- Page 17 and 18: Meten onder v MAX condities De Mich
- Page 19 and 20: Figuur 2.1 Quantum-mechanische voor
- Page 21 and 22: Het restant licht valt op de fotomu
- Page 23 and 24: Figuur 2.3 Een schematische voorste
- Page 25 and 26: tage van de intensiteit van de lich
- Page 27 and 28: Figuur 2.5 Links staat het absorpti
- Page 29 and 30: wordt het signaal dat afkomstig is
- Page 31 and 32: het sequencen van DNA de aminozuurv
- Page 33 and 34: Tabel 2.1 Effect van plaatsgerichte
- Page 35 and 36: • Meet de absorptie gedurende ong
- Page 37 and 38: Computer gegenereerde getallen (mL
- Page 39 and 40: Gebruik voor de berekening van de d
- Page 41 and 42: - Het werken met het Control panel:
- Page 43 and 44: OPDRACHTEN EN VRAGEN CG EXPERIMENT
- Page 45 and 46: Figuur 2.8 De overgangstoestand voo
- Page 47 and 48: Figuur 3.1 Kristallen van natriumur
- Page 49 and 50: Figuur 3.4 De electrode reacties va
- Page 51 and 52: Figuur 3.7 Structuur van acetylacet
- Page 53 and 54: een verhoging van de GOT activiteit
- Page 55 and 56: den worden. Dit is als volgt in te
- Page 57 and 58: HANDLEIDING VOOR HET GEBRUIK VAN HE
- Page 59 and 60: - Oplossing 2 Los 0.15 g agarose M
- Page 61: Basispracticum Biologische Chemie:
- Page 65 and 66: De ijking van de fluorimeter met 10
- Page 67 and 68: Fluorescence (AU) 1 0.9 0.8 0.7 0.6
- Page 69 and 70: Vrije energie berekeningen (ΔGº)
- Page 71 and 72: GOT is een gekoppelde meting Glutam
- Page 73 and 74: Anode (+) pool Low pH (+) Low pH (+
Immunoprecipitatie en proteomics<br />
Stap 1: bepaal het percentage (titer) GFP bindende IgG moleculen<br />
van een IgG preparaat<br />
• incubeer een oplopende concentratie GFP met een vaste<br />
hoeveelheid IgG.<br />
• verwijder IgG uit de oplossing<br />
• meet de in het supernatant achterblijvende concentratie GFP met<br />
behulp van fluorescentie<br />
Experimentele restricties<br />
• Altijd IgG dat geen antigeen bindt. Titer varieert, maar moet<br />
beter zijn dan 1%.<br />
• IgG wordt via protein A aan agarose-bolletjes gekoppeld die<br />
vervolgens mbv een centrifuge worden afgedraaid. Beperkte<br />
bindingscapaciteit via protein A. 1 µg IgG kan per incubatie<br />
worden gebonden.<br />
Immunoprecipitatie en peptide identificatie<br />
• Mbv een goed IgG preparaat wordt een GFP-getagd<br />
complex geprecipiteerd<br />
• Ontkoppel complex van IgG en scheidt de peptiden m.b.v<br />
SDS-PAGE<br />
• Extraheer een bandje uit de SDS gel en knip de<br />
polypeptideketen met trypsine<br />
• Bepaal de massa van de trypsinefragmenten met behulp<br />
van MALDI-TOF massa spectrometrie<br />
• Vergelijk de dataset van de massa’s met databases en<br />
identificeer de polypeptide keten en vervolgens het<br />
geprecipiteerde eiwitcomplex<br />
HRP<br />
SA<br />
A B<br />
A A<br />
Elisa test<br />
HRP<br />
SA<br />
A B<br />
HRP<br />
SA<br />
A B<br />
A B<br />
Y Y Y Y Y<br />
polystyreen<br />
Y= IgG; A = antigeen; B = biotine; SA = strepavidine<br />
• Variabele titer IgG per experiment.<br />
HRP<br />
SA<br />
•Verdringing van gelabeld antigeen door ongelabeld antigeen<br />
•Label wordt via een enzymactiviteitsmeting zichtbaar gemaakt<br />
PowerPoint paginanummer 3
Change language