Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

pen:
De pre-focussing
De pre-focussing stap vindt plaats bij ongeveer 2.5 mA (bij het gebruik van
één gel) met een oplopend voltage vanaf ± 200 V naar 750 V totdat 75 Vh
bereikt is. Dit duurt ongeveer 9 min.
Het opbrengen van de preparaten.
De sample applicatorarm gaat programmagestuurd naar beneden en bij een
voltage van 200 V diffundeert het preparaat de gel in. Het totale vermogen
dat gedurende dit traject (ongeveer 4.5 min) door gel wordt gestuurd is 15
Vh.
Het focusseren
Het focusseren vindt plaats bij een constant vermogen van 3.5 W per gel. Dit
wordt bereikt met een amperage van ongeveer 2 mA en een voltage aan het
begin van het experiment van 1400 V. Door een toenemende weerstand in
de gel zal het voltage tijdens het focusseren oplopen. Gemiddeld is het voltage
1650 V. Na ongeveer 15 min is er 410 Vh door de gel gegaan en wordt
het proces gestopt.
Het beëindigen van het focusseren
Door middel van een ‘piep’ wordt aangegeven dat het focusseren is afgelopen.
Hierna blijft een spanning over de gel van ongeveer 100 V gehandhaafd.
Dit om de diffusie van de eiwitten tegen te gaan. Om dit te bereiken is
het amperage ingesteld op 0.1 mA. Om af te sluiten moet op ‘SEP start stop’
gedrukt worden en moet bevestigd worden via het indrukken van ‘do’.
Tijdens het focusseren kan begonnen worden met het maken van de agarose-gel
die gebruikt gaat worden voor de fosfoglucomutase activiteitsmeting.
In situ ACTIVITEITSBEPALING VAN FOSFOGLUCOMUTASE
De weefselspecifieke fosfoglucomutase isoenzymen in de preparaten zijn
met behulp van isoelectrisch focusseren in een gel gescheiden. Dit is uitgevoerd
met het Pharmacia FastSystem in een IEF 5 8 gel. Hieronder wordt de
samenstelling gegeven van het reactiemengsel om de fosfoglucomutase
activiteit van de preparaten in een gel te meten.
Uitvoering
- Tijdens de electroforese wordt een agarose-gel gemaakt waarin de reactanten
voor de activiteitskleuring van fosfoglucomutase zijn opgelost.
- Oplossing 1
Aan 10 mL 0.125 M Tris-HCl buffer pH 7.4 wordt toegevoegd:
- 40 mg glucose 1-fosfaat
- 5 mg NADP +
- 15 μL glucose 6-fosfaat dehydrogenase
- 0.5 mL NBT (nitro blue tetrazolium) (0.5 % oplossing in H 2 O)
- 0.5 mL PMS (phenazine methosulfate) (0.2% oplossing in H 2 O)
- 56 -