Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

HANDLEIDING VOOR HET GEBRUIK VAN HET PHARMACIA FASTSY-
STEM VOOR HET ISOELECTRISCH FOCUSSEREN VAN DE WEEFSEL-
PREPARATEN
Het isoelectrisch focusseren telt drie stappen:
• het instellen van de pH gradiënt in de gel,
• het opbrengen van de preparaten
• het focusseren.
Het voltage wordt per stap aangepast (zie onderstaande handleiding Pharmacia
PhastSystemTM). Tijdens het instellen van de pH gradiënt, de pre-focuseringsstap,
kan de sample applicator klaargemaakt worden.
Let op dat je de juiste monsters op de juiste gel brengt.
Voor de PGM (PhosphoGlucoMutase) meting wordt een IEF 5-8 gel en de 6*4
sample applicator gebruikt.
Controle- en uitvoeringsstappen
- Zijn de electrodes en de koelplaat schoongemaakt door de voorganger?
Zo nee maak ze schoon met demiwater. Als het goed is staan de electrodes
in de lage stand.
- Zet het apparaat aan en stel de stand-by temperatuur door het drukken
op de toetsen ‘SEP stand-by temp’ en ‘do’.
- Maak de sample applicator 6*4 klaar. Hiertoe wordt een stuk ParafilmR
op de sample applicator-mal gelegd met het beschermende papier naar
boven. Wrijf nu bijvoorbeeld met een pen of vinger over het beschermde
parafilm zodat er in het parafilm putjes ontstaan. Leg het parafilm op een
vlak en stevig oppervlak en verwijder het beschermende papier.
- Vul de putjes in het parafilm met 6 μL van de te onderzoeken preparaten.
Druk de pipet niet helemaal leeg, dan produceer je geen belletje dat de
capillaire werking van de sample applicator kan verstoren.
- Breng per gel 100 μL water op in het midden van het rood omlijnde gelkoeloppervlak.
- Haal een gel uit de koelkast (een IEF 5-8), let op of de beschermende folie
mee uit het pakket komt of niet. Leg de gels met behulp van een pincet
zonder luchtbellen in te sluiten op het koeloppervlak binnen de rode lijnen.
Let op dat je de plastic onderkant op de plaat legt en niet de gel met
het beschermfolie. Zuig het eventuele overtollige water met papier op.
- Zuig met de sample applicator via de capillaire werking preparaat op (± 4
μL).
- Als laatste stap voor het starten van de electroforese wordt het beschermende
plastic film van de gels gehaald als deze nog aanwezig is
en wordt de electrodehouder voorzichtig op de gels geplaatst. Daarna
wordt de sample applicator in de middelste stand in de houder bevestigd.
De sample applicator mag niet met de hand op de gel geduwd
worden. Dit zal later via het programma automatisch gebeuren.
- Het deksel wordt gesloten en via het intoetsen van: ‘SEP start stop’;
number of gels ‘2’ ingeval van twee gels anders ‘1’ intoetsen; ‘do’; start SEP
method ‘7’ of ‘1’ (apparaatafhankelijk. Let op dat de juiste pH gradiënt in
de display verschijnt), ‘do’ wordt de electroforese gestart.
- De electroforese zal ongeveer 30 min in beslag nemen.
Het programma wordt bij 15 °C uitgevoerd en bestaat uit de volgende stap-
- 55 -