Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry
Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry
studeerd. Dit enzym verbindt het glycogeen metabolisme met het glucose metabolisme. Er zijn bij de mens 5 loci bekend. In spier weefsel zijn drie isoenzymen duidelijk aantoonbaar. Twee komen uit spiercellen zelf (een cytoplasmatische en een ER-membraan gebonden enzym) en een isoenzym uit rode bloedcellen. Deze drie zijn duidelijk aantoonbaar, maar als langer gekleurd wordt komen er nog twee spots op de gel bij. Bovendien kan fosfoglucomutase gefosforyleerd of gedefosforyleerd aanwezig zijn (fosforylering in spierweefsel vindt plaats via de CaM kinase. Zie Biochemistry 6de editie, p. 389 – p. 391, 5de editie p. 410 - 411). Omdat de aminozuursamenstelling door een andere aminozuurvolgorde verschilt, verschillen isoenzymen in isoelectrisch punt. Via deze eigenschap kunnen isoenzymen van elkaar gescheiden worden met isoelectrisch focusseren. HET BEPALEN VAN ISOENZYMEN MET BEHULP VAN ISOELEC- TRISCH FOCUSSEREN Doel van het experiment Het doel van dit experiment is het uitvoeren van een isoelectrisch focussering experiment en het meten van een enzymactiviteit in een gel. Bovendien moet de gel worden geïnterpreteerd. De volgende vleespreparaten die door de assistent zijn gemaakt zullen onderzocht worden op het isoenzym patroon van het enzym fosfoglucomutase. 1) 100% rundvlees (biefstuk), 2) rundergehakt 3) ‘slavink’ 4) 100% varkensvlees (hamlap) 5) 100% rundvlees (hart) 6) 60% hamlap, 20% biefstuk, 20% water Na een succesvol experiment zou het mogelijk kunnen zijn om met behulp van het fosfoglucomutase isoenzym patroon een uitspraak te kunnen doen over de aanwezigheid van rundvlees (spier of hart) en varkensvlees in rundergehakt en slavinken. Slavinken behoren naast varkensvlees ook rundvlees te bevatten. Opmerkelijk is dat op de verpakking niet wordt aangegeven of het runderskeletspier of runderhart betreft. Het Pharmacia PhastSystem: preparaateisen en gevoeligheid van de techniek Op het practicum zal het Pharmacia PhastSystemTM met een PhastGel IEF 5-8 gebruikt gaan worden. Deze prepacked gel van polyacrylamide (5% acrylamide en 3% crosslinker) en een dikte van 0.35 mm is opgebracht op een plastic plaat en bevat amfolieten die een scheiding van eiwitten met een pI van 5 tot 8 mogelijk maakt. Het monstervolume dat per preparaat nodig is bedraagt 1-6 μL. De zoutconcentratie mag niet hoger zijn dan 0.5 M NaCl en de bufferconcentratie niet hoger dan 0.05 M. De eiwitconcentratie van het op te brengen preparaat is afhankelijk van de detectiemethode. Voor een Coomassie Brilliant Blue (CBB) kleuring moet de eiwitconcentratie per polypeptideketen minstens 20-30 μg/mL zijn en maximaal 2 mg/mL. Als een gevoeliger zilverkleuring gebruikt wordt zijn de waarden 1-5 μg/mL en 0.1 mg/mL. In ons geval zal de gel niet op de aanwezigheid van eiwit worden gekleurd, maar op de aanwezigheid van het enzym fosfoglucomutase. - 54 -
HANDLEIDING VOOR HET GEBRUIK VAN HET PHARMACIA FASTSY- STEM VOOR HET ISOELECTRISCH FOCUSSEREN VAN DE WEEFSEL- PREPARATEN Het isoelectrisch focusseren telt drie stappen: • het instellen van de pH gradiënt in de gel, • het opbrengen van de preparaten • het focusseren. Het voltage wordt per stap aangepast (zie onderstaande handleiding Pharmacia PhastSystemTM). Tijdens het instellen van de pH gradiënt, de pre-focuseringsstap, kan de sample applicator klaargemaakt worden. Let op dat je de juiste monsters op de juiste gel brengt. Voor de PGM (PhosphoGlucoMutase) meting wordt een IEF 5-8 gel en de 6*4 sample applicator gebruikt. Controle- en uitvoeringsstappen - Zijn de electrodes en de koelplaat schoongemaakt door de voorganger? Zo nee maak ze schoon met demiwater. Als het goed is staan de electrodes in de lage stand. - Zet het apparaat aan en stel de stand-by temperatuur door het drukken op de toetsen ‘SEP stand-by temp’ en ‘do’. - Maak de sample applicator 6*4 klaar. Hiertoe wordt een stuk ParafilmR op de sample applicator-mal gelegd met het beschermende papier naar boven. Wrijf nu bijvoorbeeld met een pen of vinger over het beschermde parafilm zodat er in het parafilm putjes ontstaan. Leg het parafilm op een vlak en stevig oppervlak en verwijder het beschermende papier. - Vul de putjes in het parafilm met 6 μL van de te onderzoeken preparaten. Druk de pipet niet helemaal leeg, dan produceer je geen belletje dat de capillaire werking van de sample applicator kan verstoren. - Breng per gel 100 μL water op in het midden van het rood omlijnde gelkoeloppervlak. - Haal een gel uit de koelkast (een IEF 5-8), let op of de beschermende folie mee uit het pakket komt of niet. Leg de gels met behulp van een pincet zonder luchtbellen in te sluiten op het koeloppervlak binnen de rode lijnen. Let op dat je de plastic onderkant op de plaat legt en niet de gel met het beschermfolie. Zuig het eventuele overtollige water met papier op. - Zuig met de sample applicator via de capillaire werking preparaat op (± 4 μL). - Als laatste stap voor het starten van de electroforese wordt het beschermende plastic film van de gels gehaald als deze nog aanwezig is en wordt de electrodehouder voorzichtig op de gels geplaatst. Daarna wordt de sample applicator in de middelste stand in de houder bevestigd. De sample applicator mag niet met de hand op de gel geduwd worden. Dit zal later via het programma automatisch gebeuren. - Het deksel wordt gesloten en via het intoetsen van: ‘SEP start stop’; number of gels ‘2’ ingeval van twee gels anders ‘1’ intoetsen; ‘do’; start SEP method ‘7’ of ‘1’ (apparaatafhankelijk. Let op dat de juiste pH gradiënt in de display verschijnt), ‘do’ wordt de electroforese gestart. - De electroforese zal ongeveer 30 min in beslag nemen. Het programma wordt bij 15 °C uitgevoerd en bestaat uit de volgende stap- - 55 -
- Page 5 and 6: ent het experiment foutloos uit te
- Page 7 and 8: GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMEN
- Page 9 and 10: Gegevens en rekenvoorbeelden Het mo
- Page 11 and 12: worden gebracht. Een methode is de
- Page 13 and 14: Vuistregels Begin met het gebruiken
- Page 15 and 16: De reactievergelijking is: MUG + H
- Page 17 and 18: Meten onder v MAX condities De Mich
- Page 19 and 20: Figuur 2.1 Quantum-mechanische voor
- Page 21 and 22: Het restant licht valt op de fotomu
- Page 23 and 24: Figuur 2.3 Een schematische voorste
- Page 25 and 26: tage van de intensiteit van de lich
- Page 27 and 28: Figuur 2.5 Links staat het absorpti
- Page 29 and 30: wordt het signaal dat afkomstig is
- Page 31 and 32: het sequencen van DNA de aminozuurv
- Page 33 and 34: Tabel 2.1 Effect van plaatsgerichte
- Page 35 and 36: • Meet de absorptie gedurende ong
- Page 37 and 38: Computer gegenereerde getallen (mL
- Page 39 and 40: Gebruik voor de berekening van de d
- Page 41 and 42: - Het werken met het Control panel:
- Page 43 and 44: OPDRACHTEN EN VRAGEN CG EXPERIMENT
- Page 45 and 46: Figuur 2.8 De overgangstoestand voo
- Page 47 and 48: Figuur 3.1 Kristallen van natriumur
- Page 49 and 50: Figuur 3.4 De electrode reacties va
- Page 51 and 52: Figuur 3.7 Structuur van acetylacet
- Page 53 and 54: een verhoging van de GOT activiteit
- Page 55: den worden. Dit is als volgt in te
- Page 59 and 60: - Oplossing 2 Los 0.15 g agarose M
- Page 61 and 62: Basispracticum Biologische Chemie:
- Page 63 and 64: Immunoprecipitatie en proteomics St
- Page 65 and 66: De ijking van de fluorimeter met 10
- Page 67 and 68: Fluorescence (AU) 1 0.9 0.8 0.7 0.6
- Page 69 and 70: Vrije energie berekeningen (ΔGº)
- Page 71 and 72: GOT is een gekoppelde meting Glutam
- Page 73 and 74: Anode (+) pool Low pH (+) Low pH (+
studeerd. Dit enzym verbindt het glycogeen metabolisme met het glucose<br />
metabolisme. Er zijn bij de mens 5 loci bekend. In spier weefsel zijn drie<br />
isoenzymen duidelijk aantoonbaar. Twee komen uit spiercellen zelf (een<br />
cytoplasmatische en een ER-membraan gebonden enzym) en een isoenzym<br />
uit rode bloedcellen. Deze drie zijn duidelijk aantoonbaar, maar als langer<br />
gekleurd wordt komen er nog twee spots op de gel bij.<br />
Bovendien kan fosfoglucomutase gefosforyleerd of gedefosforyleerd aanwezig<br />
zijn (fosforylering in spierweefsel vindt plaats via de CaM kinase. Zie<br />
<strong>Biochemistry</strong> 6de editie, p. 389 – p. 391, 5de editie p. 410 - 411).<br />
Omdat de aminozuursamenstelling door een andere aminozuurvolgorde<br />
verschilt, verschillen isoenzymen in isoelectrisch punt. Via deze eigenschap<br />
kunnen isoenzymen van elkaar gescheiden worden met isoelectrisch focusseren.<br />
HET BEPALEN VAN ISOENZYMEN MET BEHULP VAN ISOELEC-<br />
TRISCH FOCUSSEREN<br />
Doel van het experiment<br />
Het doel van dit experiment is het uitvoeren van een isoelectrisch focussering<br />
experiment en het meten van een enzymactiviteit in een gel. Bovendien<br />
moet de gel worden geïnterpreteerd.<br />
De volgende vleespreparaten die door de assistent zijn gemaakt zullen<br />
onderzocht worden op het isoenzym patroon van het enzym fosfoglucomutase.<br />
1) 100% rundvlees (biefstuk),<br />
2) rundergehakt<br />
3) ‘slavink’<br />
4) 100% varkensvlees (hamlap)<br />
5) 100% rundvlees (hart)<br />
6) 60% hamlap, 20% biefstuk, 20% water<br />
Na een succesvol experiment zou het mogelijk kunnen zijn om met behulp<br />
van het fosfoglucomutase isoenzym patroon een uitspraak te kunnen doen<br />
over de aanwezigheid van rundvlees (spier of hart) en varkensvlees in rundergehakt<br />
en slavinken. Slavinken behoren naast varkensvlees ook rundvlees<br />
te bevatten. Opmerkelijk is dat op de verpakking niet wordt aangegeven of<br />
het runderskeletspier of runderhart betreft.<br />
Het Pharmacia PhastSystem: preparaateisen en gevoeligheid van de<br />
techniek<br />
Op het practicum zal het Pharmacia PhastSystemTM met een PhastGel IEF<br />
5-8 gebruikt gaan worden. Deze prepacked gel van polyacrylamide (5%<br />
acrylamide en 3% crosslinker) en een dikte van 0.35 mm is opgebracht op<br />
een plastic plaat en bevat amfolieten die een scheiding van eiwitten met een<br />
pI van 5 tot 8 mogelijk maakt. Het monstervolume dat per preparaat nodig<br />
is bedraagt 1-6 μL. De zoutconcentratie mag niet hoger zijn dan 0.5 M NaCl<br />
en de bufferconcentratie niet hoger dan 0.05 M. De eiwitconcentratie van<br />
het op te brengen preparaat is afhankelijk van de detectiemethode. Voor<br />
een Coomassie Brilliant Blue (CBB) kleuring moet de eiwitconcentratie per<br />
polypeptideketen minstens 20-30 μg/mL zijn en maximaal 2 mg/mL. Als een<br />
gevoeliger zilverkleuring gebruikt wordt zijn de waarden 1-5 μg/mL en 0.1<br />
mg/mL. In ons geval zal de gel niet op de aanwezigheid van eiwit worden<br />
gekleurd, maar op de aanwezigheid van het enzym fosfoglucomutase.<br />
- 54 -
Change language