Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

den worden. Dit is als volgt in te zien. De nettolading van een eiwit is net als
dat van de aminozuren waaruit een eiwit is opgebouwd afhankelijk van de
pH. Bij een lage pH zal een eiwit een positieve lading hebben, bij een hoge
pH een negatieve lading. Ergens tussen beide extremen in zal de nettolading
nul zijn. De pH waarbij dit het geval is, noemt men de pI, het isoelectrisch
punt van het eiwit.
In een electrisch veld zal een eiwit afhankelijk van zijn nettolading in de
richting van de anode (+ pool) of in de richting van de kathode (- pool)
bewegen. Wanneer het eiwit in een gel met een pH gradiënt beweegt, zal
de lading van het eiwit met de veranderende pH afnemen. Het eiwit blijft
bewegen totdat het eiwit bij zijn pI waarde is aangekomen en geen nettolading
meer heeft. Zolang de pH gradiënt in de gel stabiel is zal de diffusie die
bij andere chromatografische technieken piekverbreding geeft niet optreden
omdat het eiwit steeds weer terugbeweegt naar de pH waarde van zijn
isoelectrische punt. Deze eigenschap, het concentreren van de moleculen
is uniek voor het isoelectrisch focusseren. De stabiele pH gradiënt in de gel
wordt gevormd door speciale buffers aan de gel toe te voegen, de zogenaamde
amfolieten. Dit zijn alifatische polyamino-polycarboxyl zuren.
Tijdens de electroforese treden er bij de electroden
redoxreacties op. Bij de anode (+ pool) is dit de oxidatie
van H 2 O. De anode wordt zuur. Bij de kathode
(- pool) vindt reductie van H + plaats. De kathode
wordt dus basisch. Deze pH gradiënt zet zich ook in de
gel voort als deze niet sterk gebufferd wordt. Geladen
moleculen (waaronder eiwitten en amfolieten) gaan onder invloed van het
electrisch veld door de gel migreren. De eiwitten vanaf de plaats waar ze zijn
opgebracht en de amfolieten door de gehele gel. De amfolieten bereiken
hun pI veel sneller dan eiwitten omdat de amfolieten die veel kleiner zijn
dan eiwitten sneller diffunderen. Ook kan men voordat de eiwitten opgebracht
worden, de gel met amfolieten prefocusseren. Gezien hun amfolitisch
karakter bufferen de amfolieten de pH lokaal en houden hiermee de door de
electrode reacties veroorzaakte pH gradiënt in stand.
2- Dimensionale electroforese
De combinatie van isoelectrisch focusseren van eiwitten en SDS-PAGE in een
richting loodrecht op de richting van het isoelectrisch focusseren, noemt
men 2-dimensionale electroforese. Het oplossend vermogen van de combinatie
van deze twee electroforese technieken is zeer groot.
Isoenzymen (Biochemistry 6de editie p. 283; 5de editie p. 274 - 275)
Isoenzymen zijn enzymen die verschillen in hun aminozuurvolgorde maar
die wel dezelfde reactie katalyseren. Meestal hebben de isoenzymen verschillende
katalytische eigenschappen zoals verschillen in de KM waarde of
wordt de activiteit op een verschillende manier gereguleerd. Isoenzymen
worden altijd door verschillende genloci gecodeerd. Men neemt aan dat
isoenzymen zijn ontstaan door genduplicatie gevolgd door gendivergentie.
Wanneer een enzym op een zelfde locus op een chromosoom verschilt van
het enzym op het complementaire chromosoom dan spreekt men niet van
isoenzymen maar van genetische verschillen per individu. Bovendien kan
het zo zijn dat er expressie vanaf beide allelen plaatsvindt in heterozygoten.
In dit experiment wordt het isoenzympatroon van fosfoglucomutase be-
- 53 -