Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

Bepalingsmethode
De reacties zijn:
1) Urinezuur + 2H 2 O + O 2 allantoine + H 2 O 2 + CO 2
uricase
2) H 2 O 2 + methanol 2H 2 O + formaldehyde
katalase
3) formaldehyde + 2 acetylaceton + NH 3
3,5 diacetyl-1,4-dihydrolutidine (DDL) + 3 H 2 O
De hoeveelheid urinezuur kan kwantitatief bepaald worden door de vorming
van DDL te meten of door het O 2 gebruik te registreren.
DDL BEPALING
De urinezuurconcentratie kan gemeten worden door DDL te synthetiseren
en de gevormde hoeveelheid spectrofotometrisch te bepalen.
Het experiment wordt in duplo uitgevoerd. Pipetteer volgens het schema de
oplossingen in schone en krasvrije 3 mL plastic cuvetten. Meng de inhoud
van de cuvetten en incubeer de met parafilm afgesloten cuvetten 1 uur bij
30 °C en meet daarna de extinctie bij 410 nm tegen een cuvet gevuld met
H 2 O. Zorg ervoor dat de cuvetten droog zijn.
ZUURSTOFMETING
Via een polarografische meting van zuurstof in een oplossing is een kwantitatieve
urinezuurbepaling mogelijk. Dit gaat m.b.v. een O 2 electrode.
- Bestudeer eerst de theorie over de werking van een polarografische zuurstofelectrode.
- Kalibreer de electrode door het meetvaatje met 3 mL H 2 O te vullen en
te roeren zonder dop, totdat de uitlezing van de electrode niet meer
- 48 -
1 2 3 4 5
Urinezuurbepalingsmengsel 2.5 mL + + + + +
Urine (10x verdund met H 2 O) 0.25 mL - + + - -
Water 0.25 mL + - - - -
0.2 mM urinezuur in H 2 O 0.25 mL - - - + -
0.4 mM urinezuur in H 2 O 0.25 mL - - - - +
Uricase (2.5 mg/mL) 0.02 mL + - + + +
Tabel 3.1
Het pipetteerschema voor de
kwantitatieve urinezuurbepaling
m.b.v. de DDL synthese .