Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

cies ten opzichte van elkaar gelokaliseerd. Daarnaast heeft het eiwit via een
geprotoneerde histidine een proton beschikbaar dat nodig is om de ketogroep
van pyruvaat te protoneren tijdens de hydride aanval op het C 2 atoom
van pyruvaat. Verder stabiliseert het enzym de overgangstoestand voor de
zo juist beschreven reactie en verlaagt de vrije energie van de thermodynamische
‘drempel’ van de reactie. Door al deze interacties is de reversibele
reductie van pyruvaat door NADH mogelijk.
VERSLAG
In vivo fluorescentie
• Maak een tabel van de waarden van de absorptiemetingen tegen de
NADH concentratie.
• Geef de berekening van de concentratie van de verstrekte NADH oplossing.
Middel de getallen als ze reëel zijn.
• Bereken voor uw oplossing gelabeld 0.1 mM NADH welk percentage van
het licht door NADH geabsorbeerd wordt.
• Maak een grafiek van de NADH absorptie en de fluorescentie tegen de
NADH concentratie. Realiseer je dat het punt 0,0 ook een meetpunt is.
Verklaar waarom de lijn van de fluorescentie tegen de NADH concentratie
niet recht is en die van de extinctiemetingen wel.
• Is het mogelijk bij hogere concentraties NADH procentueel minder
quenching te krijgen door de intensiteit van het exciterende licht op te
voeren?
• Wat gebeurt er met de totale fluorescentie als de intensiteit van de lamp
wordt opgevoerd?
• Nu je de vragen over absorptie en fluorescentie hebt beantwoord wordt
je geacht enig begrip van beide methoden te hebben. Kan je aangeven
met welke methode gevoeliger te meten valt. Geef aan waarop je je uitspraken
baseert.
• Geef een gedetailleerde verklaring voor de veranderingen van de
NAD(P)H fluorescentie van de gistcellen in de tijd. Wat kunt je zeggen
over de K M waarde van het enzym dat in de glycolyse NAD + omzet in
NADH en het enzym dat NADH weer oxideert tot NAD + . Je mag aannemen
dat in het begin van het experiment er nagenoeg geen NADH
aanwezig is. Alle endogene substraten die NAD + kunnen reduceren zijn
uitgeput tijdens de hongerperiode.
• Bepaal uit de fluorescentiemeting na hoeveel seconden na het toevoegen
van de gistcellen aan het medium de gistcellen overschakelen van
een aeroob naar een anaeroob metabolisme (de NADH concentratie in
gistcellen neemt dan sterk toe). Bij welke zuurstofconcentratie vindt dit
plaats? Met andere woorden beneden welke zuurstofconcentratie wordt
cytoplasmatisch NADH niet meer effectief geoxideerd door de ademhalingsketen
van de mitochondriën? Voor de berekening van de zuurstofconcentratie
mag er van worden uitgegaan dat deze 230 μM was in de
gebruikte fosfaatbuffer.
LDH en Computer Graphics
• Presenteer de berekeningen en de antwoorden op de gestelde vragen bij
beide experimenten.
- 44 -