Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry
Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry
kunnnen worden toegevoegd in relatie tot de eindconcentraties van de reactanten. Geef ook aan welk van de drie experimenten (pH 7.0 en 8.5 gestart met pyruvaat en NADH of het experiment bij pH 8.5 gestart met lactaat en NAD + ) waarschijnlijk de betrouwbaarste waarde op zal leveren. C) Het bepalen van de bindingsconstante van NADH aan LDH Zoals reeds gegeven neemt de fluorescentie van NADH toe als het molecuul aan het enzym bindt. je kunt aannemen dat de verandering van de NADH fluorescentie rechtevenredig is met de concentratie LDH-NADH. Daarom zijn de waarnemingen geschikt om de bindingsconstante te bepalen van NADH aan LDH. Voorts kunt je aannemen dat de binding van NADH aan een subeenheid van LDH de binding van NADH aan een andere subeenheid niet beïnvloedt. De NADH fluorescentie toename kan uitgedrukt worden als een fractionele verzadigingsgraad (Y) van de binding van NADH aan LDH: LDH vrij + NADH vrij LDH-NADH complex Y = [LDH-NADH] complex / ([LDH-NADH] complex + [NADH] vrij ) (1) De waarde van Y varieert tussen de fluorescentie van het vrije NADH (geen LDH aanwezig) en de maximale toename van de fluorescentie als alle NADH gebonden is (Fluor MAX ) (overmaat LDH). Y varieert dus tussen 0 en 1. De dissociatieconstante van het LDH-NADH complex is: K D = ([LDH] vrij *[NADH] vrij )/[LDH-NADH] complex (2) M.b.v. formule (2) is [LDH-NADH] uit te drukken in [LDH], [NADH] en K D en in te vullen in (1). Na het delen van de teller en noemer door [NADH] vrij en vermenigvuldigen met K D ontstaat: Y= [LDH] vrij / ([LDH] vrij +K D ) (3) Dit is een formule van een hyperbool en vergelijkbaar met de Michaelis-Menten vergelijking. Als in plaats van Y de fractionele snelheid van een enzym (v/V max ) wordt gelezen, is de formule (3) gelijk aan de Michaelis-Menten vergelijking: v/V max = S / (S+K M ). Maar er is een groot verschil tussen activiteitsmetingen van een enzym en een bindingsstudie. In de formules zijn [LDH] en [NADH] de concentraties van de niet-gebonden moleculen. Bij een activiteitsmeting is de substraatconcentratie vaak vele malen groter dan de enzymconcentratie en dan is [S] ongebonden ~ [S] toegevoegd . Deze laatste waarde weet men omdat men die toevoegt aan het incubatiemengsel. In dit experiment zijn alleen de toegevoegde concentraties van NADH en LDH bekend. Het probleem is nu te achterhalen welke de [LDH] ongebonden en [NADH] ongebonden zijn. Deze zijn weer te bepalen als de concentratie van het LDH-NADH complex bekend is. De vrije concentratie is dan de toegevoegde concentratie min de gebonden concentratie. Wanneer je dus kans ziet een relatie te vinden tussen de fluorescentie en de concentratie van het LDH-NADH complex, kan de K D eenvoudig met de formule (2) worden uitgerekend. - 36 -
Gebruik voor de berekening van de dissociatieconstante de Excel-sheet waarmee de standaard vrije energie is uitgerekend. Kies het tab-blad Kd. In de sheet wordt een oplossing gegeven voor het numeriek schatten van de dissociatieconstante. Probeer de Excel-sheet te begrijpen. Indien je er niet uitkomt overleg dan met de assistent. C) Het bepalen van de K D van het NADH-LDH complex • Geef in het verslag de grafiek van de toename van de NADH fluorescentie bij de verschillende LDH concentraties. • Geef aan waarom de NADH fluorescentie in aceton hoger is dan in water. • Bepaal uit de waarden van de toename van de NADH fluorescentie tegen de oplopende LDH concentratie de dissociatieconstante van NADH en LDH. Verderop wordt aangegeven hoe deze valt te berekenen. Beargumenteer in het verslag hoe je de fluorescentie van het LDH-NADH complex hebt kunnen koppelen aan een concentratie. • Geef de bepaalde K D en zijn eenheid. Geef ook aan waarom je juist deze waarde hebt gekozen. ADDITIONELE INFORMATIE OVER VRIJE ENERGIE VERANDERINGEN EN REDOX POTENTIALEN A) Vrije energie en redoxpotentialen De bestudeerde reactie is: pyruvaat (A) + NADH (B) + H + lactaat (C) + NAD + (D) Deze reactie is opgebouwd uit twee redox reacties: pyruvaat wordt gereduceerd tot lactaat en NADH wordt geoxideerd tot NAD + . pyruvaat + 2e + 2H + lactaat NADH NAD + + 2e + H + . Voor het berekenen van het redoxpotentiaal verschil, de vrije energieverandering van de reactie en de evenwichtsconstante is een Excel sheet op de site van dit vak (http://biochemistry.wur.nl/practicum_Biologische_Chemie/ index.html) aanwezig. Gebruik deze Excel sheet bij het beantwoorden van de vragen. De relatie tussen de vrije energie en de redox potentiaal wordt in Biochemistry (6de editie p. 506 – p. 509, 5de editie p. 494 – p. 496) behandeld. Deze relatie is relatief simpel ΔG = - nFΔE. n = het aantal electronen die bij de redox reactie betrokken is, F is de Farady constante. R is de gasconstante en T is de temperatuur in graden Kelvin. De relatie geldt ook voor de standaard vrije energie en standaard redox potentiaal. Dus ΔG = ΔG 0 + RTln( [C].[D]/[A].[B].[H + ]) - nFΔE = - nFΔE 0 + RTln( [C].[D]/[A].[B].[H + ]). Deel door -nF. - 37 -
- Page 1 and 2: Basispracticum Biologische Chemie B
- Page 3 and 4: INHOUD In de colleges wordt de theo
- Page 5 and 6: ent het experiment foutloos uit te
- Page 7 and 8: GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMEN
- Page 9 and 10: Gegevens en rekenvoorbeelden Het mo
- Page 11 and 12: worden gebracht. Een methode is de
- Page 13 and 14: Vuistregels Begin met het gebruiken
- Page 15 and 16: De reactievergelijking is: MUG + H
- Page 17 and 18: Meten onder v MAX condities De Mich
- Page 19 and 20: Figuur 2.1 Quantum-mechanische voor
- Page 21 and 22: Het restant licht valt op de fotomu
- Page 23 and 24: Figuur 2.3 Een schematische voorste
- Page 25 and 26: tage van de intensiteit van de lich
- Page 27 and 28: Figuur 2.5 Links staat het absorpti
- Page 29 and 30: wordt het signaal dat afkomstig is
- Page 31 and 32: het sequencen van DNA de aminozuurv
- Page 33 and 34: Tabel 2.1 Effect van plaatsgerichte
- Page 35 and 36: • Meet de absorptie gedurende ong
- Page 37: Computer gegenereerde getallen (mL
- Page 41 and 42: - Het werken met het Control panel:
- Page 43 and 44: OPDRACHTEN EN VRAGEN CG EXPERIMENT
- Page 45 and 46: Figuur 2.8 De overgangstoestand voo
- Page 47 and 48: Figuur 3.1 Kristallen van natriumur
- Page 49 and 50: Figuur 3.4 De electrode reacties va
- Page 51 and 52: Figuur 3.7 Structuur van acetylacet
- Page 53 and 54: een verhoging van de GOT activiteit
- Page 55 and 56: den worden. Dit is als volgt in te
- Page 57 and 58: HANDLEIDING VOOR HET GEBRUIK VAN HE
- Page 59 and 60: - Oplossing 2 Los 0.15 g agarose M
- Page 61 and 62: Basispracticum Biologische Chemie:
- Page 63 and 64: Immunoprecipitatie en proteomics St
- Page 65 and 66: De ijking van de fluorimeter met 10
- Page 67 and 68: Fluorescence (AU) 1 0.9 0.8 0.7 0.6
- Page 69 and 70: Vrije energie berekeningen (ΔGº)
- Page 71 and 72: GOT is een gekoppelde meting Glutam
- Page 73 and 74: Anode (+) pool Low pH (+) Low pH (+
Gebruik voor de berekening van de dissociatieconstante de Excel-sheet<br />
waarmee de standaard vrije energie is uitgerekend. Kies het tab-blad Kd. In<br />
de sheet wordt een oplossing gegeven voor het numeriek schatten van de<br />
dissociatieconstante. Probeer de Excel-sheet te begrijpen. Indien je er niet<br />
uitkomt overleg dan met de assistent.<br />
C) Het bepalen van de K D van het NADH-LDH complex<br />
• Geef in het verslag de grafiek van de toename van de NADH fluorescentie<br />
bij de verschillende LDH concentraties.<br />
• Geef aan waarom de NADH fluorescentie in aceton hoger is dan in water.<br />
• Bepaal uit de waarden van de toename van de NADH fluorescentie tegen<br />
de oplopende LDH concentratie de dissociatieconstante van NADH en<br />
LDH. Verderop wordt aangegeven hoe deze valt te berekenen. Beargumenteer<br />
in het verslag hoe je de fluorescentie van het LDH-NADH complex<br />
hebt kunnen koppelen aan een concentratie.<br />
• Geef de bepaalde K D en zijn eenheid. Geef ook aan waarom je juist deze<br />
waarde hebt gekozen.<br />
ADDITIONELE INFORMATIE OVER VRIJE ENERGIE VERANDERINGEN EN<br />
REDOX POTENTIALEN<br />
A) Vrije energie en redoxpotentialen<br />
De bestudeerde reactie is:<br />
pyruvaat (A) + NADH (B) + H + lactaat (C) + NAD + (D)<br />
Deze reactie is opgebouwd uit twee redox reacties: pyruvaat wordt gereduceerd<br />
tot lactaat en NADH wordt geoxideerd tot NAD + .<br />
pyruvaat + 2e + 2H + lactaat<br />
NADH NAD + + 2e + H + .<br />
Voor het berekenen van het redoxpotentiaal verschil, de vrije energieverandering<br />
van de reactie en de evenwichtsconstante is een Excel sheet op de<br />
site van dit vak (http://biochemistry.wur.nl/practicum_<strong>Biologische</strong>_<strong>Chemie</strong>/<br />
index.html) aanwezig. Gebruik deze Excel sheet bij het beantwoorden van de<br />
vragen.<br />
De relatie tussen de vrije energie en de redox potentiaal wordt in <strong>Biochemistry</strong><br />
(6de editie p. 506 – p. 509, 5de editie p. 494 – p. 496) behandeld. Deze<br />
relatie is relatief simpel ΔG = - nFΔE. n = het aantal electronen die bij de<br />
redox reactie betrokken is, F is de Farady constante. R is de gasconstante en<br />
T is de temperatuur in graden Kelvin. De relatie geldt ook voor de standaard<br />
vrije energie en standaard redox potentiaal.<br />
Dus ΔG = ΔG 0 + RTln( [C].[D]/[A].[B].[H + ]) -<br />
nFΔE = - nFΔE 0 + RTln( [C].[D]/[A].[B].[H + ]).<br />
Deel door -nF.<br />
- 37 -
Change language