Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

Computer
gegenereerde
getallen
(mL LDH)
0 0
0.01 0.71
0.03 2.14
0.06 4.27
0.10 7.12
0.15 10.68
0.21 14.95
0.28 19.94
0.36 25.63
0.45 32.04
0.55 39.16
0.66 46.99
0.78 55.54
[LDH] µM NADH fluorescentie
De NADH concentratie
was steeds
4 μM
Tabel 2.3
Effect van een toenemende LDH
concentratie op de NADH fluorescentie
(computer gegenereerde
getallen).
Additionele gegevens
1) De diëlectrische constante van aceton is 20.7, die van water
80.4.
2) NADH fluoresceert meer in een apolaire omgeving dan in
water.
3) Een functioneel LDH enzym in vivo bestaat uit vier subunits
(H4, H3M, H2M2, HM3 of M4).
4) Het molecuulgewicht van het hier te gebruiken varkenshartspier
enzym is 35112 g per subunit, dus is 2.5 mg/mL 71.2
μM LDH subunits. 10 μL LDH van 2.5 mg/mL in 1 mL geeft een
concentratie van 0.71 μM LDH-subunits.
5) Elke subeenheid heeft een katalytische plaats en bindt één
molecuul NADH, één molecuul pyruvaat of oxamaat.
HET UITWERKEN VAN HET LDH EXPERIMENT (LDH-2)
A) De activiteitsmeting van lactaat dehydrogenase
1) Trek een raaklijn aan extinctiedaling geregistreerd op de
recorderrol. Doe dit voor de vier activiteitsmetingen. Gebruik
het gegeven dat de schaal op de recorder loopt van extinctie
nul naar extinctie 1.
• Bereken uit de absorptiedaling de initiële activiteit van LDH
onder de experimentele omstandigheden van de vier uitgevoerde
activiteitsmetingen. De activiteit moet worden gegeven
in μmol NADH geoxideerd. s -1 . mg LDH -1 . Gebruikt de recordersnelheid
(meestal 3 cm/minuut) om de beginactiviteit uit
te rekenen. Voor de berekening moet je de formule E = ε x c
gebruiken.
De ε voor NADH is 6300 M -1 .cm -1 .
• Vergelijk de metingen van pyruvaat en pyruvaat + oxamaat
bij pH 7.0. Is het mogelijk op basis van bovenstaande uitgerekende
gegevens te bepalen of oxamaat remt en zo ja of oxamaat
een competitieve dan wel een niet-competitieve remmer is?
• Als dit niet mogelijk is welke experimenten moet men dan uitvoeren om
dit wel te kunnen bepalen? Zie Biochemistry (6 de editie p. 226 – p. 227,
5 de editie p. 210).
B) Het bepalen van de standaard vrije energieverandering van de reductie
van pyruvaat tot lactaat door NADH
• Bereken uit de beginextinctie van NADH en de extinctieveranderingen
na toevoegen van LDH concentraties NADH, pyruvaat, lactaat en NAD + in
evenwicht bij pH 7 en pH 8.5 (de experimenten 1, 3 en 4). Gebruik hierbij
de door de assistent bepaalde pyruvaatconcentratie.
• Bereken met behulp van de Excel sheet de standaard vrije energie en de
evenwichtsconstante van de reactie bij pH 7.0 en 8.5.
• Geef aan of de experimenteel berekende constantes in overeenstemming
zijn met de literatuurgegevens die in de Excel sheet gegeven worden.
• Als het experiment niet in overeenstemming is met de theorie, welke additionele
gegevens zijn er dan nog nodig? Denk hierbij aan de zuiverheid
van de gebruikte reagentia, de nauwkeurigheid waarmee de reagentia
- 35 -