Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

tenhouder van de SpectroPlus in de fluorescentie stand. Het cuvettenhuis
wordt met de deksel en een zwarte lap afgesloten. Zet nu de functieknop
op ‘Fluorescence’ en vergeet niet het strooilichtfilter uit de lichtweg te
halen.
- De uitlezing wordt met behulp van de “zero”knop op 0.00 gezet. Na ongeveer
30 seconden is de uitlezing stabiel.
- Voordat het deksel van het cuvettenhuis wordt afgehaald, wordt de functieknop
op “O 2 ” gedraaid en het strooilichtfilter in de lichtweg geduwd.
- Voeg nu aan het cuvet 40 μL 0.1 mM NADH toe en meng de inhoud van
het cuvet voorzichtig. Let op dat het cuvet weer precies recht achter het
spiegelblokje staat. Meet de fluorescentie en vul de waarde in tabel 2.2 in.
2) NADH fluorescentie in aceton
- Herhaal dit experiment met 0.96 mL aceton in plaats van KP i buffer. Voeg
na het op ‘nul’ zetten 40 μL 0.1 mM NADH toe en meet de fluorescentie.
Vul het getal in tabel 2.2 in.
3) NADH fluorescentie in aanwezigheid van lactaat dehydrogenase en
het effect van oxamaat (3a)
- Nu wordt de fluorescentie van NADH gemeten waarbij een gedeelte van
het NADH aan LDH gebonden is. Dit wordt bewerkstelligd door 0.03 mL
LDH (2.5 mg/mL ) aan 0.93 mL KP i buffer toe te voegen. De fluorescentieuitlezing
van het cuvet met buffer en LDH wordt op nul gezet.
- Vervolgens wordt 40 μL NADH toegevoegd en wordt de fluorescentie
opnieuw gemeten en wordt de waarde in tabel 2.2 ingevuld. Vergeeft niet
te mengen.
- Vervolgens wordt aan het zojuist gemeten cuvet (3) 0.01 mL oxamaat (10
mM) toegevoegd. Registreer de fluorescentie-uitlezing en vul deze ook in
tabel 2.2 in (waarneming 3a).
4) NADH fluorescentie bij oplopende lactaat dehydrogenase concentraties
Voor het bepalen van een bindingsconstante zijn een groot aantal metingen
bij een vaste NADH concentratie en variabele LDH concentraties
nodig. Om het pipetteren te verminderen zullen deze waarden virtueel
worden verkregen. De door je gevonden fluorescentie van 4 μM NADH
(de meting van buffer + NADH) en de fluorescentie van 4 μM NADH +
2.13 μM LDH (de meting van 0.03 mL LDH, 2.5 mg/mL + NADH) worden
in het programma LDHEXP ingevoerd. Uw getallen worden gebruikt om
een volledige titratie te simuleren. De gesimuleerde getallen kunnen
worden gebruikt om tabel 2.3 in te vullen.
Incubatie mL LDH
(2.5 mg/mL )
- 34 -
1 0 0.96 buffer 0
2 0 0.96 aceton 0
3 0.03 0.93 buffer 2.14
3a plus 0.01 mL 10 mM
Oxamaat
Tabel 2.2
Fluorescentie van NADH onder verschillende condities
mL buffer/aceton [LDH] μM Fluorecentie toename/afname door
de laatste toevoeging
2.14