Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

• Meet de absorptie gedurende ongeveer 1 minuut.
• Voeg 0.02 mL LDH (0.1 mg/mL ) toe, meng en plaats het cuvet zo snel
mogelijk na het mengen terug in de spectrofotometer.
• Meet de absorptiedaling op de recorder totdat de uitlezing stabiel is.
4) LDH activiteitsmeting met lactaat bij pH = 8.5
Voeg aan een 1 mL cuvet de volgende oplossingen toe en voer de aangegeven
handelingen uit:
• Voeg 0.97 mL 0.1 M Tris-HCl buffer pH = 8.5 toe
• Voeg 0.01 mL 1 M lactaat toe en meng de oplossing in het cuvet.
• Plaats het cuvet in de spectrofotometer en zet de absorptie op nul via de
‘set ref’ knop.
• Voeg 0.01 mL 10 mM NAD + toe en meng.
• Meet de absorptie gedurende ongeveer 1 minuut.
• Voeg 0.01 mL LDH (0.1 mg/mL ) toe, meng en plaats het cuvet zo snel
mogelijk na het mengen terug in de spectrofotometer.
• Meet de absorptietoename op de recorder totdat de uitlezing stabiel is.
HET BEPALEN VAN DE BINDINGSCONSTANTE VAN NADH AAN LDH
m.b.v. FLUORESCENTIE
De binding van NADH aan het enzym lactaat dehydrogenase kan bestudeerd
worden door de verandering van de NADH fluorescentie te meten.
Het blijkt namelijk dat de NADH fluorescentie toeneemt als NADH aan het
enzym bindt. Deze toename van de NADH fluorescentie wordt ook gevonden
als men NADH in een meer apolair oplosmiddel oplost. Vandaar dat te
verwachten is dat het bindingsoppervlak van NADH in het enzym apolair is.
Tijdens de bindingsexperimenten reageert NADH niet omdat het tweede
substraat van het enzym, pyruvaat, niet wordt toegevoegd. Wel wordt oxamaat
toegevoegd. Dit molecuul is een isosterisch en isoelectronisch analoog
van pyruvaat en bindt analoog aan pyruvaat aan het enzym. Maar omdat
de methylgroep van pyruvaat is vervangen door een aminegroep is NADH
niet in staat oxamaat te reduceren. Dit komt door de electronenstuwende
eigenschappen van de aminegroep. Als het goed is heeft je zojuist gezien
dat oxamaat geen afname van de NADH absorptie gaf, en dus niet wordt
omgezet door LDH.
Uitvoering van het experiment
- De assistent heeft de gevoeligheidsknop (gain) maximaal gezet en de EHT
op 5. De functieknop van de SpectroPlus staat als een experiment begonnen
wordt op ‘O2’ en het strooilichtfilter ‘< 350 nm’ staat in de lichtweg. De
golflengte staat op 359 nm en de cuvettenhouder heeft een ‘UV’ (300-400
nm) filter en een 408 nm afkapfilter. Het cuvet wordt in de 90° fluorescentie
stand gemeten. Zie in vivo fluorescentie en het fluorescentie theoriedeel
figuur 2.4.
- In alle experimenten wordt de NADH concentratie constant gehouden,
namelijk 4 μM.
1) NADH fluorescentie in buffer
- Pipetteer 0.97 mL KP i buffer (0.1 M, pH 7.0) in een 1 mL cuvet. Zet het
cuvet steeds precies recht achter het spiegelblokje in de cuvettenhouder
van een SpectroPlus, de ‘doffe’ kant richting fotomultiplier. Plaats de cuvet-
- 33 -