Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

EXPERIMENTEEL GEDEELTE VAN LACTAAT DEHYDROGENASE
(LDH-1)
Het meten van de lactaat dehydrogenase activiteit
In dit experiment wordt de activiteit van lactaat dehydrogenase gemeten.
Dit wordt uitgevoerd met een Pharmacia spectrofotometer. De activiteit
van het hartspier LDH isoenzym (H4) wordt gemeten door de absorptie van
NADH, een van de substraten in de reactie, bij 340 nm in de tijd te volgen. Er
worden vier experimenten uitgevoerd waarbij de activiteit met pyruvaat ±
oxamaat + NADH en met lactaat + NAD + wordt bepaald. De reactie vergelijking
is:
pyruvaat + NADH + H + lactaat + NAD +
1) LDH activiteitsmeting met pyruvaat bij pH = 7.0
Voeg aan een 1 mL cuvet de volgende oplossingen toe en voer de aangegeven
handelingen uit:
• Voeg 0.97 mL 0.1 M KP i (kaliumfosfaat buffer) pH 7.0 toe
• Voeg 0.01 mL 10 mM pyruvaat toe en meng de oplossing in het cuvet.
• Plaats het cuvet in de spectrofotometer en zet de absorptie op nul via de
‘set ref’ knop.
• Voeg 0.01 mL 10 mM NADH toe en meng.
• Meet de absorptie gedurende ongeveer 1 minuut.
• Voeg 0.01 mL LDH (0.1 mg/mL ) toe, meng en plaats het cuvet zo snel
mogelijk na het mengen terug in de spectrofotometer.
• Meet de absorptiedaling op de recorder totdat de uitlezing stabiel is.
2) LDH activiteitsmeting met oxamaat bij pH = 7.0
Voeg aan een 1 mL cuvet de volgende oplossingen toe en voer de aangegeven
handelingen uit:
• Voeg 0.96 mL 0.1 M KP i pH 7.0 toe
• Voeg 0.01 mL 10 mM oxamaat toe en meng de oplossing in het cuvet.
• Plaats het cuvet in de spectrofotometer en zet de absorptie op nul via de
‘set ref’ knop.
• Voeg 0.01 mL 10 mM NADH toe en meng.
• Meet de absorptie gedurende ongeveer 1 minuut.
• Voeg 0.01 mL LDH (0.1 mg/mL ) toe en meng.
• Registreer de absorptie veranderingen. Wanneer er geen noemenswaardige
reactie optreedt, wordt aan het cuvet 0.01 mL 10 mM pyruvaat
toegevoegd. Na toevoegen van pyruvaat en mengen moet het cuvet zo
snel mogelijk terug geplaatst worden in de spectrofotometer en wordt de
absorptie gedurende ongeveer 3 minuten gevolgd.
3) LDH activiteitsmeting met pyruvaat bij pH = 8.5
Voeg aan een 1 mL cuvet de volgende oplossingen toe en voer de aangegeven
handelingen uit:
• Voeg 0.96 mL 0.1 M Tris-HCl buffer pH = 8.5 toe
• Voeg 0.01 mL 10 mM pyruvaat toe en meng de oplossing in het cuvet.
• Plaats het cuvet in de spectrofotometer en zet de absorptie op nul via de
‘set ref’ knop.
• Voeg 0.01 mL 10 mM NADH toe en meng.
- 32 -
Figuur 2.7
Het absorptie spectrum van
NADH en NAD +