Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

Tabel 2.1
Effect van plaatsgerichte mutagenese
op de katalytische eigenschappen
van lactaat dehydrogenase.
Arg 106 betekent dat het 106 de
aminozuur vanaf het NH2-terminale
uiteinde van de polypeptideketen
arginine is.
fluorescentie. Deze is lager wanneer NADH is gebonden. Ook kan men de
fluorescentie van een fluorescent substraat volgen. Bijvoorbeeld de NADH
fluorescentie neemt toe wanneer NADH bindt aan LDH. Wanneer nu naast
NADH, pyruvaat bindt neemt de fluorescentie van het gebonden NADH
weer af en deze verdwijnt volledig wanneer NAD + en lactaat zijn gevormd.
Uit dit soort pre-steady-state experimenten bepaalt men de snelheidconstantes
van de verschillende deelreacties van de katalytische cyclus.
Plaatsgerichte mutagenese (Biochemistry 6de editie p. 147 – p. 148; 5de
editie, p. 164 - p. 165)
Daarnaast is het maken en karakteriseren van mutant enzymen een belangrijk
hulpmiddel om het werkingsmechanisme van enzymen te begrijpen.
Met behulp van plaatsgerichte mutagenese (zie is men tegenwoordig in
staat heel specifiek aminozuurresiduen in enzymen te veranderen. Nadat
een aminozuurresidu is veranderd wordt het effect op kinetische eigenschappen
van het enzym bestudeerd. In de tabel 2.1 zijn een aantal aminozuurveranderingen
in LDH en hun kinetisch effecten samengevat.
Samenvattend
Door de kinetiekgegevens met structuurgegevens te combineren, is men
in staat een werkingsmodel voor een enzym op te stellen. Dit is het belangrijkste
leerdoel van dit in silico experiment. Om het structuurgedeelte van
dit experiment zinvol door te werken is het noodzakelijk dat je de volgende
zaken paraat heeft (in uw hoofd of op papier):
• de structuur van de aminozuren,
• het begrip pKa in relatie tot de ladingseigenschappen van de aminozuurresiduen,
• de begrippen ionogene binding, van der Waals interactie, waterstofbindingen
en het hydrofobe effect.
Deze gegevens zijn in Biochemistry 6de editie p. 6 – p. 10, p. 14 – p. 17,
p. 27 – p. 34; 5de editie p. 8 – p. 11, p. 43 – p. 44, p. 50 en p. 73 – p. 74 te
vinden.
Effecten verandering aminozuursamenstelling op eigenschappen van LDH
Arg106 in Gln106: De hydride overdrachtsnelheid is sterk gereduceerd (< 0.07 % van de wildtype activiteit).
De pyruvaat binding is verminderd, maar er is geen effect op de coenzymbinding.
Tevens neemt de NADH fluorescentie niet significant af na het toevoegen van
oxamaat. Dit vindt wel plaats in het wildtype enzym.
Asp166 in Ala166 of Asn166 Vermindering van de bindingsaffiniteit voor pyruvaat maar niet voor lactaat. Tevens
wordt een verlaging van hydride overdrachtsnelheid gevonden.
Arg169 in Lys169 De bindingsaffiniteit voor pyruvaat is slechts 0.05%
Ile249 in Asn249 Verlaging van de bindingsaffiniteit voor NADH en pyruvaat
- 31 -