Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

Zoals bij elke chemische reactie bepalen de concentraties van de reactanten
de richting van de reactie. Voor de door LDH gekatalyseerde reactie bepalen
dus de concentraties van pyruvaat/lactaat en NAD + /NADH en de pH of de
reactie naar links of naar rechts zal verlopen. Daarnaast katalyseren weefselspecifieke
isoenzymen de heen- en teruggaande-reactie met verschillende
snelheden en is de substraatremming (pyruvaatremming) verschillend. Hartcellen
bevatten het isoenzym H4 (vier identieke subeenheden van het type
H, die tezamen een enzymcomplex vormen). Skeletspiercellen en levercellen
bevatten veel isoenzym M4. H4 wordt geremd door hoge pyruvaatconcentraties
zal dus niet de lactaatvorming katalyseren. Het enzym katalyseert bij
voorkeur de oxidatie van lactaat. M4 heeft geen last van de pyruvaatremming
en wordt dus gebruikt in cellen voor de reductie van pyruvaat naar
lactaat.
Het kinetisch gedrag van LDH is karakteristiek voor nagenoeg alle pyridine
nucleotide (NAD(P)(H)) afhankelijke dehydrogenasen. NADH bindt eerst
aan het enzym gevolgd door pyruvaat. Na de hydride (H - ) overdracht vanaf
NADH naar pyruvaat en protonering van de ketogroep, verlaat lactaat als
eerste het enzym, gevolgd door NAD + . Dit type reactie wordt een ordered
sequential mechanisme genoemd. In het onderstaande schema zijn de acht
intermediaire vormen van het enzym weergegeven (zie figuur 2.6).
Het bepalen van de verschillende reacties van een katalytische cyclus
De verschillende reacties en hun snelheidsconstantes zijn bepaald met
klassieke ‘steady-state’ en snelle ‘pre-steady-state’ kinetiek. Bij steady-state
kinetiek meet men de langzaamste stap(pen) van de katalytische cyclus.
Door bijvoorbeeld de substraatconcentratie(s) te variëren van een enzymactiviteitsmeting,
krijgt men informatie over de reacties waarbij de binding
van de substraten aan het enzym van belang zijn. De tijdschaal van deze
experimenten is vanaf een paar seconden tot enige minuten. Bij pre-steadystate
kinetiek kijkt men naar eigenschappen van het enzym tijdens het
‘eerste rondje’ van de katalytische cyclus. Men mengt enzym zeer snel met
het substraat (binnen 2 milliseconden)
en kijkt naar een of meerdere
eigenschappen van het enzym,
het substraat of het enzym-substraatcomplex.
Een eigenschap
die waardevolle informatie kan
geven over de katalytisch cyclus is
de tryptofaan fluorescentie. In alle
eiwitten is de tryptofaan fluorescentie
afhankelijk van zijn microomgeving
en die kan veranderen
met de verschillende conformaties
van het enzym. Door nu de tryptofaan
fluorescentie te volgen in de
tijd, tijdens het eerste rondje van de
cyclus, kan men informatie krijgen
over conformatie veranderingen in
het enzym. Bijvoorbeeld: het vrije
enzym heeft een grote tryptofaan
- 30 -
Figuur 2.6
De verschillende conformaties
van lactaatdehydrogenase in een
volledige reactiecyclus. merk op
dat het een ‘ordered sequential’
mechanisme is.