Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

wordt afgesloten en wel zodanig dat er geen luchtbelletjes meer in het
reactievaatje tussen de vloeistof en de dop aanwezig zijn.
• De zuurstofconcentratie wordt in de tijd op de recorder gevolgd.
• Wanneer de zzurstofconcentratie drie minuten onveranderd is gebleven,
wordt 5 µL aceetaldehyde toegevoegd, waarna de meting nog ongeveer
5 minuten wordt gevolgd.
• Voeg daarna 5 µL 2.5% H 2 O 2 en wacht totdat de toegevoegde waterstofperoxide
(via het enzym katalase wordt dit omgezet tot zuurstof) is
verbruikt door de gistcellen.
HET WERKINGSMECHANISME VAN LACTAAT DEHYDROGENASE
Doel van het experiment
De onderstaande proeven worden uitgevoerd met als doel inzicht te verkrijgen
in enzymkatalyse en de bijbehorende thermodynamica.
Hiertoe wordt:
1) de activiteit van het enzym lactaat dehydrogenase met pyruvaat, oxamaat
en lactaat bij verschillende pH’s gemeten en wordt gewacht totdat
de reactie in evenwicht is gekomen.
2) de binding van NADH aan het enzym gevolgd met behulp van fluorescentie.
3) met behulp de fluorescentie waarden de bindingsconstante van NADH
aan lactaat dehydrogenase uitgerekend.
4) Bij de activiteitsmetingen is de reactie gevolgd totdat de NADH concentratie
niet meer veranderd. Dit geeft aan dat de reactie in evenwicht is en
met behulp van de extinctieveranderingen zullen de concentraties van
de reactanten worden uitgerekend. De concentraties van de reactanten
in de evenwichtssituatie worden gebruikt om de standaard vrije energie
van de reactie uit te rekenen.
5) Als laatste wordt de kristalstructuur van het enzym op het computerscherm
bestudeerd.
Door de experimenten te combineren ben je in staat te begrijpen hoe het
enzym de reactie katalyseert. Tevens hopen we dat je dan enig inzicht heeft
verkregen in de manier waarop enzymen werken, namelijk het verlagen van
de activeringsenergie waardoor reacties die zonder katalysator niet plaatsvinden
nu gecontroleerd in de cel kunnen verlopen.
Inleiding
Voor het verkrijgen van inzicht in het werkingsmechanisme van enzymen
is de structuur van het enzym onontbeerlijk. De afgelopen jaren is de structuurbepaling
van enzymen en eiwitten in een stroomversnelling geraakt.
Deze ontwikkeling is mogelijk gemaakt door het beschikbaar komen van
geavanceerde apparatuur voor het opnemen van de Röntgen verstrooiingspatronen
van een eiwitkristal, snelle computers voor het uitrekenen van de
Röntgen verstrooiingspatronen en het zichtbaar maken van driedimensionale
structuren op een computerscherm.
De tweede factor is de ontwikkeling van de recombinant DNA technologie.
Met behulp van deze technologie is het relatief eenvoudig geworden om via
- 28 -