Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

wordt het signaal dat afkomstig is van de fotomultiplier negatief weergegeven.
Meer licht op de fotomultiplier en dus een lagere uitlezing.
• Na het meten van de fluorescentie van een cuvet met alleen buffer
(blanco), wordt nu de fluorescentie van alle bereide NADH oplossingen (5
tot en met 200 μM) in 1 mL glascuvetten gemeten.
• Controleer af en toe of de blanco nog steeds een uitlezing van nul geeft.
Zo nee, stel deze bij met de zeroknop.
• In het verslag moet je de waargenomen fluorescentie uitzetten tegen de
NADH concentratie. Ook moet je nu je getallen met die van je collega’s
vergelijken. In het verslag moet je aangeven wat je opvalt en hoe dit te
verklaren is.
3) IN VIVO FLUORESCENTIE VAN NADH IN GISTCELLEN
• Voordat je de oplossingen in een cuvet gaat pipetteren, moet je doornemen
welke handelingen er uitgevoerd moeten worden en wordt de
recorder aangezet. Dit is nodig omdat onmiddellijk na het toevoegen van
de gistcellen aan het cuvet de reactie gaat verlopen en dus de registratie
van de fluorescentie zo snel mogelijk moet plaatsvinden. Noteer op de
recorder het tijdstip waarop de gistcellen aan het cuvet worden toegevoegd.
Realiseer je dat de reactie start ook al wordt de fluorescentie niet
geregistreerd!
• 2.44 mL (aërobe) KP i buffer (0.1 M, pH 7.0) en 0.06 mL glucose (1 M) wordt
in een 3 mL quartzcuvet gepipetteerd. Het cuvet wordt in de cuvettenhouder
geplaatst in de frontface instelling (zie figuur 2.4; afbeelding C
van Theorie van lichtabsorptie en fluorescentie). Het exitatielicht is 360
nm en er wordt gemeten op EHT stand 5. Wanneer alle instellingenn juist
zijn en de afspraken gemaakt wordt 0.5 mL gistsuspensie (10% w/v, 4 uur
gehongerd om het niveau van de endogene substraten te verlagen) aan
het cuvet dat in de cuvettenhouder staat toegevoegd. Geef dit moment
aan op het recorderpapier. De inhoud van het cuvet wordt gemengd en
wordt in het apparaat geplaatst. Daarna wordt met de zeroknop zo snel
mogelijk de uitlezing op ± -200 ingesteld. De fluorescentie wordt in de
tijd (ongeveer 15 minuten) op de recorder gevolgd.
• Als de uitlezing stabiel geworden is, wordt 5 μL aceetaldehyde (3 M) aan
het cuvet toegevoegd. Na voorzichtig mengen wordt de fluorescentie
gevolgd totdat de oorspronkelijke fluorescentie weer is bereikt..
• Nu wordt 5 µL 2.5% H 2 O 2 toegevoegd en na mengen wordt de fluorescentie
weer gevolgd totdat het niveau van voor de toevoeging weer is
bereikt.
4) ZUURSTOFMETING
In een oxygraaf wordt de zuurstofconcentratie in een oplossing gemeten. De
werking van een oxygraaf wordt bij de urinezuurproef van blok 3 uitgelegd.
Het bovenstaande experiment is de NADH fluorescentie in gistcellen gevolgd.
Nu wordt het experiment in het reactievaatje van een zuurstofmeter
(oxygraaf) uitgevoerd. De zuurstofconcentratie wordt onder precies dezelfde
omstandigheden gevolgd als de fluorescentiemeting.
• 2.44 mL aërobe KP i buffer (0.1 M, pH 7.0) en 0.06 mL glucose (1 M) wordt
in het reactievaatje van een oxygraaf gepipetteerd. Als laatste wordt 0.5
mL gistsuspensie toegevoegd waarna de oxygraaf met de speciale dop
- 27 -