Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry
Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry
nm in een één mL cuvet t.o.v. een cuvet met Tris/HCl buffer met het strooilichtfilter in de lichtweg. Schrijf de waarden op want deze heeft je voor het schrijven van het verslag nodig. Uit deze waarden moet je met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt van NADH bij 340 nm (ε = 6300 M -1 .cm -1 ) de exacte concentratie van de verstrekte NADH oplossing uitrekenen. 2) FLUORESCENTIEMETINGEN De SpectroPlus als fluorimeter: het detecteren van NADH fluorescentie Met de onderstaande procedure kan men een fluorescentiemeting van NADH uitvoeren. Het apparaat is zo geconstrueerd dat wanneer er meer licht op de fotomultilplier valt de uitlezing een negatiever getal zal aangeven. Dus hoe negatiever het getal op de display hoe meer fluorecentie wordt geproduceerd en waargenomen. • Voor het meten van de NADH fluorescentie zet men de monochromator op 360 nm. • De metingen worden met de EHT knop op 4 in de 90° fluorescentie instelling uitgevoerd (zie figuur 2.4 van theoriedeel over absorptie en fluorescentie). De gain-knop is door de assistent op zijn maximale waarde gezet. • Voordat bij een fluorescentiemeting het deksel van het cuvettenhuis wordt gehaald moet de functieknop op “O 2 ” worden gezet en het strooilichtfilter in de lichtweg worden geduwd. • De excitatiegolflengte is 360 nm en de lichtbundel valt via het UV-filter (laat alleen licht tussen 300 en 400 nm door) op het spiegeltje in de cuvettenhouder en vervolgens op het cuvet. Het geëmitteerde licht wordt via een 408 nm afkapfilter gemeten. Let op dat de cuvettenhouder goed in de pinnetjes wordt gezet. • Nadat het deksel op het cuvettenhuis is geplaatst, mag de functieknop op “fluor” worden gezet en wordt het strooilichtfilter uit de lichtweg gehaald. Er wordt eventueel een zwartelap over het cuvettendeksel gelegd voor een optimale afdichting. • Bij het verwisselen van cuvetten wordt dezelfde procedure in omgekeerd volgorde uitgevoerd. Eerst wordt het strooilichtfilter in de lichtweg geplaatst, vervolgens wordt de functieknop op O 2 gezet. Daarna wordt het deksel van het cuvettenhuis weggehaald. Het meten van de relatie tussen de NADH concentratie en NADH fluorescentie: het fenomeen (zelf)quenching • Maak nog een aantal verdunningen van de NADH oplossing met het opschrift 1 mM. De volgende verduningen in buffer (10 mM Tris/HCl, pH 8.0) moeten worden gemaakt zodanig dat er 1 mL van 5, 10, 40 en 80 μM NADH beschikbaar is om gemeten te worden. De oplossingen van 20, 100 en 200 μM heb je al gemaakt en gebruikt voor extinctiemetingen. Een oplossing met alleen Tris-buffer wordt als blanco (aftelpunt = datapunt 0, 0) gebruikt. • De metingen worden met de EHT knop op 4 in de 90º fluorescentie instelling (zie figuur 2.4) uitgevoerd. • De uitlezing van een cuvet met alleen buffer (blanco) wordt met de ‘zero’knop op ‘0.0’ gezet. In tegenstelling tot extinctiemetingen geeft meer fluorescentie een grotere negatieve uitlezing. In de fluorescentiestand - 26 -
wordt het signaal dat afkomstig is van de fotomultiplier negatief weergegeven. Meer licht op de fotomultiplier en dus een lagere uitlezing. • Na het meten van de fluorescentie van een cuvet met alleen buffer (blanco), wordt nu de fluorescentie van alle bereide NADH oplossingen (5 tot en met 200 μM) in 1 mL glascuvetten gemeten. • Controleer af en toe of de blanco nog steeds een uitlezing van nul geeft. Zo nee, stel deze bij met de zeroknop. • In het verslag moet je de waargenomen fluorescentie uitzetten tegen de NADH concentratie. Ook moet je nu je getallen met die van je collega’s vergelijken. In het verslag moet je aangeven wat je opvalt en hoe dit te verklaren is. 3) IN VIVO FLUORESCENTIE VAN NADH IN GISTCELLEN • Voordat je de oplossingen in een cuvet gaat pipetteren, moet je doornemen welke handelingen er uitgevoerd moeten worden en wordt de recorder aangezet. Dit is nodig omdat onmiddellijk na het toevoegen van de gistcellen aan het cuvet de reactie gaat verlopen en dus de registratie van de fluorescentie zo snel mogelijk moet plaatsvinden. Noteer op de recorder het tijdstip waarop de gistcellen aan het cuvet worden toegevoegd. Realiseer je dat de reactie start ook al wordt de fluorescentie niet geregistreerd! • 2.44 mL (aërobe) KP i buffer (0.1 M, pH 7.0) en 0.06 mL glucose (1 M) wordt in een 3 mL quartzcuvet gepipetteerd. Het cuvet wordt in de cuvettenhouder geplaatst in de frontface instelling (zie figuur 2.4; afbeelding C van Theorie van lichtabsorptie en fluorescentie). Het exitatielicht is 360 nm en er wordt gemeten op EHT stand 5. Wanneer alle instellingenn juist zijn en de afspraken gemaakt wordt 0.5 mL gistsuspensie (10% w/v, 4 uur gehongerd om het niveau van de endogene substraten te verlagen) aan het cuvet dat in de cuvettenhouder staat toegevoegd. Geef dit moment aan op het recorderpapier. De inhoud van het cuvet wordt gemengd en wordt in het apparaat geplaatst. Daarna wordt met de zeroknop zo snel mogelijk de uitlezing op ± -200 ingesteld. De fluorescentie wordt in de tijd (ongeveer 15 minuten) op de recorder gevolgd. • Als de uitlezing stabiel geworden is, wordt 5 μL aceetaldehyde (3 M) aan het cuvet toegevoegd. Na voorzichtig mengen wordt de fluorescentie gevolgd totdat de oorspronkelijke fluorescentie weer is bereikt.. • Nu wordt 5 µL 2.5% H 2 O 2 toegevoegd en na mengen wordt de fluorescentie weer gevolgd totdat het niveau van voor de toevoeging weer is bereikt. 4) ZUURSTOFMETING In een oxygraaf wordt de zuurstofconcentratie in een oplossing gemeten. De werking van een oxygraaf wordt bij de urinezuurproef van blok 3 uitgelegd. Het bovenstaande experiment is de NADH fluorescentie in gistcellen gevolgd. Nu wordt het experiment in het reactievaatje van een zuurstofmeter (oxygraaf) uitgevoerd. De zuurstofconcentratie wordt onder precies dezelfde omstandigheden gevolgd als de fluorescentiemeting. • 2.44 mL aërobe KP i buffer (0.1 M, pH 7.0) en 0.06 mL glucose (1 M) wordt in het reactievaatje van een oxygraaf gepipetteerd. Als laatste wordt 0.5 mL gistsuspensie toegevoegd waarna de oxygraaf met de speciale dop - 27 -
- Page 1 and 2: Basispracticum Biologische Chemie B
- Page 3 and 4: INHOUD In de colleges wordt de theo
- Page 5 and 6: ent het experiment foutloos uit te
- Page 7 and 8: GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMEN
- Page 9 and 10: Gegevens en rekenvoorbeelden Het mo
- Page 11 and 12: worden gebracht. Een methode is de
- Page 13 and 14: Vuistregels Begin met het gebruiken
- Page 15 and 16: De reactievergelijking is: MUG + H
- Page 17 and 18: Meten onder v MAX condities De Mich
- Page 19 and 20: Figuur 2.1 Quantum-mechanische voor
- Page 21 and 22: Het restant licht valt op de fotomu
- Page 23 and 24: Figuur 2.3 Een schematische voorste
- Page 25 and 26: tage van de intensiteit van de lich
- Page 27: Figuur 2.5 Links staat het absorpti
- Page 31 and 32: het sequencen van DNA de aminozuurv
- Page 33 and 34: Tabel 2.1 Effect van plaatsgerichte
- Page 35 and 36: • Meet de absorptie gedurende ong
- Page 37 and 38: Computer gegenereerde getallen (mL
- Page 39 and 40: Gebruik voor de berekening van de d
- Page 41 and 42: - Het werken met het Control panel:
- Page 43 and 44: OPDRACHTEN EN VRAGEN CG EXPERIMENT
- Page 45 and 46: Figuur 2.8 De overgangstoestand voo
- Page 47 and 48: Figuur 3.1 Kristallen van natriumur
- Page 49 and 50: Figuur 3.4 De electrode reacties va
- Page 51 and 52: Figuur 3.7 Structuur van acetylacet
- Page 53 and 54: een verhoging van de GOT activiteit
- Page 55 and 56: den worden. Dit is als volgt in te
- Page 57 and 58: HANDLEIDING VOOR HET GEBRUIK VAN HE
- Page 59 and 60: - Oplossing 2 Los 0.15 g agarose M
- Page 61 and 62: Basispracticum Biologische Chemie:
- Page 63 and 64: Immunoprecipitatie en proteomics St
- Page 65 and 66: De ijking van de fluorimeter met 10
- Page 67 and 68: Fluorescence (AU) 1 0.9 0.8 0.7 0.6
- Page 69 and 70: Vrije energie berekeningen (ΔGº)
- Page 71 and 72: GOT is een gekoppelde meting Glutam
- Page 73 and 74: Anode (+) pool Low pH (+) Low pH (+
nm in een één mL cuvet t.o.v. een cuvet met Tris/HCl buffer met het<br />
strooilichtfilter in de lichtweg. Schrijf de waarden op want deze heeft je<br />
voor het schrijven van het verslag nodig. Uit deze waarden moet je met<br />
behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt van NADH bij 340 nm (ε =<br />
6300 M -1 .cm -1 ) de exacte concentratie van de verstrekte NADH oplossing<br />
uitrekenen.<br />
2) FLUORESCENTIEMETINGEN<br />
De SpectroPlus als fluorimeter: het detecteren van NADH fluorescentie<br />
Met de onderstaande procedure kan men een fluorescentiemeting van<br />
NADH uitvoeren. Het apparaat is zo geconstrueerd dat wanneer er meer licht<br />
op de fotomultilplier valt de uitlezing een negatiever getal zal aangeven. Dus<br />
hoe negatiever het getal op de display hoe meer fluorecentie wordt geproduceerd<br />
en waargenomen.<br />
• Voor het meten van de NADH fluorescentie zet men de monochromator<br />
op 360 nm.<br />
• De metingen worden met de EHT knop op 4 in de 90° fluorescentie instelling<br />
uitgevoerd (zie figuur 2.4 van theoriedeel over absorptie en fluorescentie).<br />
De gain-knop is door de assistent op zijn maximale waarde gezet.<br />
• Voordat bij een fluorescentiemeting het deksel van het cuvettenhuis<br />
wordt gehaald moet de functieknop op “O 2 ” worden gezet en het strooilichtfilter<br />
in de lichtweg worden geduwd.<br />
• De excitatiegolflengte is 360 nm en de lichtbundel valt via het UV-filter<br />
(laat alleen licht tussen 300 en 400 nm door) op het spiegeltje in de cuvettenhouder<br />
en vervolgens op het cuvet. Het geëmitteerde licht wordt<br />
via een 408 nm afkapfilter gemeten. Let op dat de cuvettenhouder goed<br />
in de pinnetjes wordt gezet.<br />
• Nadat het deksel op het cuvettenhuis is geplaatst, mag de functieknop<br />
op “fluor” worden gezet en wordt het strooilichtfilter uit de lichtweg gehaald.<br />
Er wordt eventueel een zwartelap over het cuvettendeksel gelegd<br />
voor een optimale afdichting.<br />
• Bij het verwisselen van cuvetten wordt dezelfde procedure in omgekeerd<br />
volgorde uitgevoerd. Eerst wordt het strooilichtfilter in de lichtweg geplaatst,<br />
vervolgens wordt de functieknop op O 2 gezet. Daarna wordt het<br />
deksel van het cuvettenhuis weggehaald.<br />
Het meten van de relatie tussen de NADH concentratie en NADH fluorescentie:<br />
het fenomeen (zelf)quenching<br />
• Maak nog een aantal verdunningen van de NADH oplossing met het<br />
opschrift 1 mM. De volgende verduningen in buffer (10 mM Tris/HCl, pH<br />
8.0) moeten worden gemaakt zodanig dat er 1 mL van 5, 10, 40 en 80 μM<br />
NADH beschikbaar is om gemeten te worden. De oplossingen van 20, 100<br />
en 200 μM heb je al gemaakt en gebruikt voor extinctiemetingen. Een<br />
oplossing met alleen Tris-buffer wordt als blanco (aftelpunt = datapunt 0,<br />
0) gebruikt.<br />
• De metingen worden met de EHT knop op 4 in de 90º fluorescentie instelling<br />
(zie figuur 2.4) uitgevoerd.<br />
• De uitlezing van een cuvet met alleen buffer (blanco) wordt met de ‘zero’knop<br />
op ‘0.0’ gezet. In tegenstelling tot extinctiemetingen geeft meer<br />
fluorescentie een grotere negatieve uitlezing. In de fluorescentiestand<br />
- 26 -
Change language