Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

Figuur 2.5
Links staat het absorptiespectrum
van NADH, rechts het fluorescentie
emissie spetrum. Merk op dat de
schaalverdeling op beide y-assen
verschilt en dat fluorescentie optreedt
bij hogere golflengten dan
lichtabsorptie.
(in vivo) FLUORESCENTIE
Doel van het experiment
In dit experiment wordt het verschil in gevoeligheid en de concentratieafhankelijkheid
van een extinctie- en een fluorescentiemeting bestudeerd en
vergeleken. Dit wordt gedaan door:
1) de extinctie van verschillende NADH oplossingen te meten.
2) de fluorescentie van dezelfde NADH oplossingen te meten
3) Vervolgens wordt de kracht van fluorescentie aangetoond door de NADH
concentratie in intacte gistcellen met behulp van fluorescentie te volgen
bij de overgang van een aëroob naar een anaëroob energiemetabolisme.
4) Het proces zal ook nog gevolgd worden via het meten van de zuurstofconcentratie
van de gistoplossing met behulp van een zuurstofelectrode.
In figuur 2.5 is het absorptiespectrum van NADH weergegeven
en het uit de absorptie voorkomende spectrum van
het fluorescentielicht. NADH absorbeert voldoende licht
tussen de 300 en 360 nm en de fluorescentie kan met een
fliter dat licht met een golflengte boven de 408 nm worden
gedetecteerd. Licht laten absorberen bij 360 nm (dan is de
intensiteit van de lichtbron veel hoger dan bij 340 nm) en de
fluorescentie meten boven de 408 nm kan dus prima met
een SpectroPlus.
Bediening van een SpectroPlus
Voordat je begint met de metingen is het noodzakelijk dat
je je realiseert hoe het apparaat, de SpectroPlus, in elkaar zit
waarmee je de metingen zult gaan uitvoeren. De assistent
heeft je in de inleiding over dit blok het onderstaande laten zien.
1) Het cuvettenhuis kan op drie posities geplaatst worden ten opzichte van
de fotomultiplier. Geef je rekenschap in welke posities je een extinctiemeting
moet uitvoeren en in welke positie een fluorescentiemeting mogelijk
is (Zie figuur 2.4). Overtuig je waar je het cuvet in de houder moet neerzetten
om een 90° fluorescentie en een 60° (front face) meting te kunnen
uitvoeren.
2) Voordat bij een fluorescentiemeting het deksel van het cuvettenhuis
wordt gehaald moet de functieknop op “O 2 ” worden gezet en het strooilichtfilter
in de lichtweg worden geduwd. Dit is nodig omdat anders de
fotomultiplier door teveel licht ‘opgeblazen’ wordt.
1) EXTINCTIEMETINGEN
SpectroPlus als spectrofotometer: een extinctiemeting van NADH
• Zet de monochromator op 340 nm.
• Er is door de assistent een NADH oplossing gemaakt. Deze oplossing is
ongeveer 1 mM. Gebruik deze oplossing om oplossingen van 0.02, 0.1 en
0.2 mM NADH in 10 mM Tris/HCl pH 8.0 te maken. Eén mL van elke oplossing
is voldoende. Bewaar de oplossingen voor een fluorescentiemeting!
Realiseer je dat de blanco, het punt 0,0 in een grafiek, ook een meetpunt
is.
• Meet de extinctie van de 0.02, 0.1 en 0.2 mM NADH oplossingen bij 340
- 25 -