Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

ehandeld die de hoeveelheid fluorescentie beïnvloeden.
C) Kwantumefficiëntie
In principe zouden alle moleculen die licht absorberen fluorescent kunnen zijn,
maar deze eigenschap is sterk molecuul afhankelijk. De verhouding tussen de
geabsorbeerde lichtquanta en de uitgezonden lichtquanta noemt men de kwantumefficiëntie.
Er zijn moleculen, zoals fluoresceïne die 60-90 % van het geabsorbeerde
licht weer uitzenden. Andere moleculen, zoals NADH, hebben slechts
een kwantumefficiëntie van 2 %.
Naast de structuur van het molecuul spelen ook de omgevingsfactoren een
belangrijke rol in de kwantumefficiëntie. Factoren zoals polariteit, viscositeit en
temperatuur bepalen de kwantumefficiëntie. Vooral de polariteit en viscositeit
zijn belangrijke factoren omdat deze informatie geven over de micro-omgeving
van fluorescente groepen in eiwitten. Dit kan een fluorescente groep zijn die
aan het eiwit gebonden is, zoals NADH. De meeste eiwitten hebben intrinsieke
fluorescente groepen. Deze zijn de aromatische aminozuurresiduen tryptofaan
en tyrosine. Confirmatieveranderingen in eiwitten veroorzaken soms een verandering
van de polariteit van de fluorescente groep hetgeen zich manifesteert
via een veranderende fluorescentie. Ook de binding van een fluorescente groep
aan een eiwit kan een verandering van de polariteit van de micro-omgeving ten
gevolg hebben die zich als een fluorescentie verandering laat registreren.
D) Verandering van de verhouding stralend/stralingsloos verval (quenching)
Sommige ionen (b.v. Br - of I - ) nemen bij een botsing met een aangeslagen molecuul
de energie van het terugvallende elektron op zodat er geen licht wordt
uitgezonden.
E) Absorptie van het uitgezonden licht
Het uitgezonden licht kan door de fluorescerende moleculen zelf worden geabsorbeerd,
maar omdat het excitatie- en het emissiespectrum nauwelijks overlappen
(zie figuur 2.1), is deze bijdrage meestal gering. Wel is absorptie door andere
moleculen, waarvan het absorptiespectrum een significante overlap met het
emissiespectrum vertoont, een niet te verwaarlozen bijdrage.
SAMENVATTING VAN DE VERSCHILLEN TUSSEN EEN EXTINCTIE- EN
EEN FLUORESCENTIEMETING
In de fluorescentie instelling wordt het fotomultipliersignaal lineair versterkt.
Bij een goed geconstrueerd apparaat zal er uitsluitend fluorescentielicht op de
fotomultiplier vallen. Hierdoor kan men de versterking opvoeren en dit geeft de
mogelijkheid om zeer kleine lichthoeveelheden te kunnen waarnemen. Fluorescentie
is om deze reden veel gevoeliger te meten dan lichtabsorptie. In het geval
van lichtabsorptie meet je de afname van je 100% signaal. Een kleine afname
van 100% is veel minder goed electronisch te versterken dan een kleine toename
met geen signaal als uitgangspunt. Een nadeel van fluorescentie is dat de
grootte van het signaal apparaat afhankelijk is. Bij het ene apparaat is de lichtintensiteit
die op het cuvet valt anders dan bij het andere apparaat en de gevoeligheid
van de fotomultiplier verschilt van apparaat tot apparaat. Dit heeft tot
gevolg dat men het signaal altijd moet ijken. Dit is bij een extinctiemeting niet
nodig omdat een extinctiemeting altijd ten opzichte van een blanco plaatsvindt.
Hierdoor wordt de uitkomst van de meting onafhankelijk van de intensiteit van
de lichtbundel.
- 24 -