Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

tage van de intensiteit van de lichtbundel ter plaatse geabsorbeerd. Omdat de fluorescentie
rechtevenredig is met het aantal moleculen dat aangeslagen wordt, zal
een twee keer intensere lichtbundel twee keer zoveel moleculen aanslaan en dus
een twee keer grotere fluorescentie ten gevolg hebben. Dus door de intensiteit
van de lichtbundel op te voeren wordt de fluorescentie rechtevenredig verhoogd.
Het verschil in lichtintensitiet verschilt van apparaat tot apparaat en is een belangrijke
reden waarom de fluorescentie apparaat afhankelijk is. Ook de gevoeligheid
van de fotomultiplier voor licht is een oorzaak voor een verschil in gevoeligheid
tussen apparaten.
B) De concentratie van de absorberende stof (zelf-quenching)
Gezien het bovenstaande (meer absorptie, meer fluorescentie) zou men kunnen
denken dat een hogere concentratie van de absorberende stof rechtevenredig
meer fluorescentie zou geven. Het is niet het geval. Hierbij dient men zich te realiseren
dat extinctie- en fluorescentiemetingen essentieel verschillen. Bij een extinctiemeting
meet men de intensiteit van de lichtbundel nadat deze het gehele
cuvet doorlopen heeft. Door lichtabsorptie is de intensiteit van de lichtbundel in
het cuvet exponentieel met de afgelegde weg afgenomen. In de fluorescentieinstelling
doorloopt de lichtbundel uit de monochromator ook het cuvet maar nu
onder een hoek van 90º ten opzichte van de fotomultiplier. Ook nu weer neemt de
intensiteit van de lichtbundel exponentieel af met de doorlopen weglengte. Vanuit
elk punt in de lichtweg wordt t.g.v. de lichtabsorptie fluorescentie uitgezonden
die via het afkapfilter door de fotomultiplier wordt geregistreerd. De waargenomen
fluorescentie is dus een directe afspiegeling van de absolute hoeveelheid
licht die in het cuvet geabsorbeerd wordt. De relatie tussen de concentratie van
de absorberende stof en de hoeveelheid geabsorbeerd licht is niet lineair. Dit is
als volgt in te zien:
De absorptie is op elke plek in het cuvet rechtevenredig (k) met de I (de intensiteit
van de lichtbundel) ter plaatse en de concentratie van de absorberende moleculen.
Een deel (fractie) van het geabsorbeerde licht wordt weer uitgezonden. De
intensiteit van de fluorescentie is dus: fractie*k*c*I. De I neemt door de absorptie
(A = ε*c = ln(10)*ε*c=k*c) af volgens formule (1): I = I 0 *e -k*c*x (1)
(I 0 = de intensiteit van de lichtbundel die op het cuvet valt; x = de afgelegde lichtweg)
De fluorescentie op positie x is, f(x) = fractie*k*c*I(x) = fractie*k*c* I 0 *e -k*c*x
De formule f(x) is te integreren en wordt dan
F(x) = fractie*k*c*I 0 *1/(-k*c)*e -k*c*x en geeft als integraal tussen x = 1 en x = 0
cm: F(1)-F(0) = fractie*I 0 (1- e-k*c).
De fluorescentie die bij een bepaalde concentratie c uit een cuvet komt is dus:
F(1)-F(0) = fluorescentie uit een cuvet = fractie*I 0 (1- e -k*c ).
Deze formule geeft dus de relatie tussen de waargenomen fluorescentie en de
concentratie van de absorberende en fluorescerende stof. Uit de formule blijkt dat
de toename van de fluorescentie bij een oplopende concentratie van de fluorescente
stof exponentieel afvlakt. Het deel van de formule tussen de ‘haakjes’ nadert
dan naar 1 omdat de e-macht naar nul gaat. De relatieve afname van de fluorescentie
bij hogere concentraties noemt men zelf-quenching. Quenching in zijn
algemeenheid is het verschijnsel dat men minder fluorescentie waarneemt dan
dat men op grond van de feitelijke concentratie van de fluorescerende moleculen
zou verwachten. Naast zelf-quenching worden hieronder nog een aantal factoren
- 23 -