Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

More documents

Recommendations

Info

ichting wordt veranderd. Dit licht wordt dan door een afkapfilter dat tussen het cuvet en de fotomultiplier is geplaatst tegengehouden. De moleculen die licht hebben geabsorbeerd en in een aangeslagen toestand zijn geraakt, gaan binnen 10 8 s terug naar de grondtoestand waarbij een gedeelte van de moleculen licht zal uitzenden (fluorescentie). Dit licht wordt in alle richtingen uitgezonden. Het afkapfilter tussen het cuvet en de fotomultiplier is zo gekozen dat het excitatielicht geabsorbeerd en het fluorescentielicht doorgelaten wordt. Het doorgelaten licht wordt vervolgens door de fotomultiplier geregistreerd. Om de lichtbundel via een spiegeltje in het cuvettenhuis van de SpectroPlus 90º om te buigen moet de cuvettenstang volledig worden ingedrukt. Zie figuur 2.4. Wanneer de oplossing helder is en als het fluorescentielicht niet te sterk geabsorbeerd wordt door moleculen in de oplossing, kan het cuvet in de positie naast het spiegeltje in de cuvettenhouder geplaatst worden. De lichtbundel wordt via de gladde kant door een één mL cuvet geleid. De fluorescentie wordt onder 90º met de exciterende lichtbundel waargenomen. Dit is de 90º fluorescentie instelling (Figuur 2.4, afbeelding 2). De fluorescentie kan via de doffe kant worden waargenomen. De doffe kant verstrooit het reeds verstrooide fluorescentielicht nauwelijks meer (met een cuvet met rondom gladde kanten wordt slechts een 10% hoger signaal gemeten). Ook is het mogelijk het cuvet een positie verder te zetten. Let dan goed op dat het afstandsblokje de exciterende lichtbundel en fluorescentie niet onderbreekt. De fluorescentie wordt onder een hoek van 60º waargenomen waarbij de fluorescentie van een klein gedeelte van het cuvet afkomstig is. Omdat dit het oppervlak van het cuvet is wordt deze manier van fluorescentie meten een front-face fluorescentiemeting genoemd (Figuur 2.4, afbeelding 3). Als men op deze manier de fluorescentie meet is deze minder gevoelig voor quenching, omdat het traject in het cuvet waarover gemeten wordt veel minder is. Wel is de gevoeligheid geringer omdat er minder fluorescentielicht vanuit het cuvet op de fotomultiplier kan vallen. FACTOREN DIE DE INTENSITEIT VAN DE FLUORESCENTIE BEÏNVLOEDEN A) De intensiteit van de exciterende lichtbundel Zoals hierboven is weergegeven, is de lichtabsorptie rechtevenredig met de concentratie van de absorberende moleculen en wordt er altijd een percen- - 22 - Figuur 2.4 De plaats van het cuvet bij een aborptiemeting, een 90º fluorescentiemeting en een 60º ‘front face’ fluorescentiemeting
tage van de intensiteit van de lichtbundel ter plaatse geabsorbeerd. Omdat de fluorescentie rechtevenredig is met het aantal moleculen dat aangeslagen wordt, zal een twee keer intensere lichtbundel twee keer zoveel moleculen aanslaan en dus een twee keer grotere fluorescentie ten gevolg hebben. Dus door de intensiteit van de lichtbundel op te voeren wordt de fluorescentie rechtevenredig verhoogd. Het verschil in lichtintensitiet verschilt van apparaat tot apparaat en is een belangrijke reden waarom de fluorescentie apparaat afhankelijk is. Ook de gevoeligheid van de fotomultiplier voor licht is een oorzaak voor een verschil in gevoeligheid tussen apparaten. B) De concentratie van de absorberende stof (zelf-quenching) Gezien het bovenstaande (meer absorptie, meer fluorescentie) zou men kunnen denken dat een hogere concentratie van de absorberende stof rechtevenredig meer fluorescentie zou geven. Het is niet het geval. Hierbij dient men zich te realiseren dat extinctie- en fluorescentiemetingen essentieel verschillen. Bij een extinctiemeting meet men de intensiteit van de lichtbundel nadat deze het gehele cuvet doorlopen heeft. Door lichtabsorptie is de intensiteit van de lichtbundel in het cuvet exponentieel met de afgelegde weg afgenomen. In de fluorescentieinstelling doorloopt de lichtbundel uit de monochromator ook het cuvet maar nu onder een hoek van 90º ten opzichte van de fotomultiplier. Ook nu weer neemt de intensiteit van de lichtbundel exponentieel af met de doorlopen weglengte. Vanuit elk punt in de lichtweg wordt t.g.v. de lichtabsorptie fluorescentie uitgezonden die via het afkapfilter door de fotomultiplier wordt geregistreerd. De waargenomen fluorescentie is dus een directe afspiegeling van de absolute hoeveelheid licht die in het cuvet geabsorbeerd wordt. De relatie tussen de concentratie van de absorberende stof en de hoeveelheid geabsorbeerd licht is niet lineair. Dit is als volgt in te zien: De absorptie is op elke plek in het cuvet rechtevenredig (k) met de I (de intensiteit van de lichtbundel) ter plaatse en de concentratie van de absorberende moleculen. Een deel (fractie) van het geabsorbeerde licht wordt weer uitgezonden. De intensiteit van de fluorescentie is dus: fractie*k*c*I. De I neemt door de absorptie (A = ε*c = ln(10)*ε*c=k*c) af volgens formule (1): I = I 0 *e -k*c*x (1) (I 0 = de intensiteit van de lichtbundel die op het cuvet valt; x = de afgelegde lichtweg) De fluorescentie op positie x is, f(x) = fractie*k*c*I(x) = fractie*k*c* I 0 *e -k*c*x De formule f(x) is te integreren en wordt dan F(x) = fractie*k*c*I 0 *1/(-k*c)*e -k*c*x en geeft als integraal tussen x = 1 en x = 0 cm: F(1)-F(0) = fractie*I 0 (1- e-k*c). De fluorescentie die bij een bepaalde concentratie c uit een cuvet komt is dus: F(1)-F(0) = fluorescentie uit een cuvet = fractie*I 0 (1- e -k*c ). Deze formule geeft dus de relatie tussen de waargenomen fluorescentie en de concentratie van de absorberende en fluorescerende stof. Uit de formule blijkt dat de toename van de fluorescentie bij een oplopende concentratie van de fluorescente stof exponentieel afvlakt. Het deel van de formule tussen de ‘haakjes’ nadert dan naar 1 omdat de e-macht naar nul gaat. De relatieve afname van de fluorescentie bij hogere concentraties noemt men zelf-quenching. Quenching in zijn algemeenheid is het verschijnsel dat men minder fluorescentie waarneemt dan dat men op grond van de feitelijke concentratie van de fluorescerende moleculen zou verwachten. Naast zelf-quenching worden hieronder nog een aantal factoren - 23 -
Page 1 and 2: Basispracticum Biologische Chemie B
Page 3 and 4: INHOUD In de colleges wordt de theo
Page 5 and 6: ent het experiment foutloos uit te
Page 7 and 8: GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMEN
Page 9 and 10: Gegevens en rekenvoorbeelden Het mo
Page 11 and 12: worden gebracht. Een methode is de
Page 13 and 14: Vuistregels Begin met het gebruiken
Page 15 and 16: De reactievergelijking is: MUG + H
Page 17 and 18: Meten onder v MAX condities De Mich
Page 19 and 20: Figuur 2.1 Quantum-mechanische voor
Page 21 and 22: Het restant licht valt op de fotomu
Page 23: Figuur 2.3 Een schematische voorste
Page 27 and 28: Figuur 2.5 Links staat het absorpti
Page 29 and 30: wordt het signaal dat afkomstig is
Page 31 and 32: het sequencen van DNA de aminozuurv
Page 33 and 34: Tabel 2.1 Effect van plaatsgerichte
Page 35 and 36: • Meet de absorptie gedurende ong
Page 37 and 38: Computer gegenereerde getallen (mL
Page 39 and 40: Gebruik voor de berekening van de d
Page 41 and 42: - Het werken met het Control panel:
Page 43 and 44: OPDRACHTEN EN VRAGEN CG EXPERIMENT
Page 45 and 46: Figuur 2.8 De overgangstoestand voo
Page 47 and 48: Figuur 3.1 Kristallen van natriumur
Page 49 and 50: Figuur 3.4 De electrode reacties va
Page 51 and 52: Figuur 3.7 Structuur van acetylacet
Page 53 and 54: een verhoging van de GOT activiteit
Page 55 and 56: den worden. Dit is als volgt in te
Page 57 and 58: HANDLEIDING VOOR HET GEBRUIK VAN HE
Page 59 and 60: - Oplossing 2 Los 0.15 g agarose M
Page 61 and 62: Basispracticum Biologische Chemie:
Page 63 and 64: Immunoprecipitatie en proteomics St
Page 65 and 66: De ijking van de fluorimeter met 10
Page 67 and 68: Fluorescence (AU) 1 0.9 0.8 0.7 0.6
Page 69 and 70: Vrije energie berekeningen (ΔGº)
Page 71 and 72: GOT is een gekoppelde meting Glutam
Page 73 and 74: Anode (+) pool Low pH (+) Low pH (+

Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?