Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

Figuur 2.3
Een schematische voorstelling
van de opbouw van een
fluorimeter
stof in het cuvet beïnvloed en Is niet of nauwelijks.
- Dit heeft tot gevolg dat ingeval van de aanwezigheid van strooilicht
ΔE = log[(I m blanco +I s )/(I m +I s )].
- Als er geen strooilicht is dan is ΔE = log[(I m blanco )/(I m )].
- Als het monster veel licht absorbeert, is I m klein ten opzichte van
I blanco . In dit geval vergroot Is de noemer van de breuk (I m blanco +I s )/
(I m +I s ) meer dan de teller.
- Omdat I m altijd kleiner is dan I blanco betekent dit dat strooilicht de
waargenomen extinctie altijd zal verlagen.
Uit het bovenstaande is duidelijk dat de verhouding strooilicht/monochromatisch
licht de nauwkeurigheid van een extinctiemeting beïnvloedt.
Deze verhouding wordt ongunstig als intensiteit van het lamplicht bij een
bepaalde golflengte laag wordt. Dit is het geval bij een wolfraamlamp bij
golflengten beneden 350 nm. Om het strooilicht weg te vangen kan men bij
golflengten < 350 nm een filter tussen het cuvet en de fotomultiplier plaatsen.
Dit filter absorbeert het licht met een golflengte > 350 nm. Dit is het
niet-monochromatische strooilicht.
FLUORIMETRIE
De opbouw van een fluorimeter en het meten van fluorescentie
Fluorescentie wordt met de SpectroPlus in de fluorescentie-instelling gemeten.
De basiscomponenten zijn in figuur 2.3 weergegeven. Qua opbouw verschilt
een fluorimeter
weinig met een spectrofotometer,
maar er
zijn twee belangrijke
verschillen. Omdat
de intensiteit van de
fluorescentie vaak
vele malen zwakker
is dan de intensiteit
van de exciterende
lichtbundel moet
gezorgd worden dat
er nauwelijks of geen
exciterend licht op de
fotomultiplier valt. Dit
zou een hoog achtergrondsignaal
geven hetgeen de nauwkeurigheid van de fluorescentiemeting
nadelig beïnvloedt.
Bij een fluorescentiemeting met de ‘SpectroPlus’ laat men de lichtbundel die
uit de monochromator komt eerst via een spiegeltje in het cuvettenhuis een
hoek van 90º maken voordat de lichtbundel op het cuvet valt (zie figuur 2.4).
In het cuvet wordt licht door de aanwezige moleculen geabsorbeerd. Dit
verschilt niet van een normale extinctiemeting. De intensiteit van de lichtbundel
neemt dus exponentieel af met de afgelegde afstand in het cuvet.
Omdat de lichtbundel uit de monochromator 90º is afgebogen bereikt
deze de fotomultiplier niet. Wel is het mogelijk dat door verstrooiing door
stofdeeltjes in het cuvet een gedeelte van de exciterende lichtbundel van
- 21 -