Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

signaal (Iblanco) van de fotomultiplier. Daarna plaatst men het cuvet met
het monster in de lichtweg en meet hoeveel licht er nu op de fotomultiplier
valt: I meting . Tussen de twee metingen in is de I 0 niet veranderd. De I 0 is de
lichtintensiteit die via de lamp en monochromator het cuvet intreedt. De
relatie tussen het concentratieverschil van de absorberende stof in de twee
cuvetten en het signaal van de fotomultiplier van de twee metingen is:
- voor de blanco geldt dat logI 0 /I blanco = ε*c bl *l
- voor het monster geldt dat logI 0 /I meting = ε*c m *l
- het verschil is (met l = 1 cm) ΔE = logI 0 / I meting - logI 0 / I blanco
= ε* (c m -c bl ). ΔE = logI blanco - logI meting = ε * Δc
Bij een moderne spectrofotometer bestaat de mogelijkheid om de blanco op
“0” te zetten. Vaak heeft het apparaat een knop met “set ref”. Wat gebeurt er
dan? Met behulp van electronica wordt het signaal dat van de fotomuliplier
afkomt en verwerkt wordt door een logaritmische versterker op 1 gezet.
Dit signaal is dan het signaal van de blanco. Omdat log 1 nul is verschijnt er
0.000 op de display. Als nu het cuvet met het monster wordt gemeten zal er
lichtabsorptie optreden en wordt het signaal kleiner dan 1 omdat er in dit
geval minder licht op de fotomultiplier valt. De logaritme van een getal kleiner
dan 1 is een negatief getal. De electronica zorgt ervoor dat nu de negatieve
logaritme van het signaal (I) van de fotomultiplier wordt weergegeven
(-logI). Dit wordt dan een positief getal en is direct het lichtabsoptieverschil
tussen de blanco en het monster. Omdat de blanco op “0” was gezet geeft
het getal op de display de extinctie aan en via de extinctie coëfficient is de
concentratie van de absorberende stof eenvoudig uit te rekenen.
E = ε * c.
Het is belangrijk om je te realiseren dan wanneer men praat over de extinctie
van een oplossing, men het verschil in lichtabsorptie tussen de oplossing en
een blanco heeft gemeten. Deze blanco bevat alle ingrediënten die ook in
de oplossing aanwezig zijn behalve de stof waarvan men de lichtabsorptie
wil meten.
De termen extinctie en absorptie worden in de Biochemie door elkaar gebruikt.
In de fysische chemie is de absorptie van een oplossing het deel van
het invallende licht dat geabsorbeerd wordt. In formule is de absorptie dan
(I 0 -I)/I 0 , waarbij I 0 -I de hoeveelheid licht is die geabsorbeerd is.
Strooilicht als foutenbron
Al het licht dat op de fotomultiplier valt en dat niet de golflengte heeft waarop
de monochromator is ingesteld, of dat niet door het meetcuvet is gegaan
en toch de fotomultiplier bereikt, noemt men strooilicht. Naast een niet
goed afsluitend cuvettencompartiment, veroorzaakt de monochromator het
meeste strooilicht. Dit is lamplicht dat op een of andere manier niet gesplitst
in golflengten op de uitgangsspleet van de monochromator terechtkomt.
Als er sprake is van strooilicht dan is het licht dat op de fotomultiplier valt,
opgebouwd uit twee componenten: I m en I s
- I m (het monochromatische licht) en I s (het strooilicht)
- I m wordt wel door concentratie veranderingen van de absorberende
- 20 -
Samenvatting lichtabsorptie
Wanneer moleculen licht absorberen
neemt de lichtintensiteit
van de lichtbundel exponentieel
afneemt in de oplossing.
Hierdoor is de relatie logaritme
van de lichtintensiteit - absorptie
lineair. Hiervan wordt door de
fabrikanten van spectrofotometers
gebruik gemaakt.
Een spectrofotometer geeft op
de display een logaritme van de
lichtintensiteit weer. Vandaar dat
de relatie ΔE (verschil in extinctie
tussen monster en blanco) en Δc
lineair is. De constante die beide
grootheden gelijk maakt is de
molaire extinctie coëfficiënt ε
ΔE = ε Δc