Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

Het restant licht valt op de fotomultiplier die een stroompje afgeeft dat
via een versterker op de recorder of de display zichtbaar gemaakt wordt.
De versterkingsfactor van de fotomultiplier kan worden ingesteld door de
hoogspanning op de fotomultiplier te variëren. Dit gaat via de Extra High
Tension, ‘EHT’-knop. Een hogere waarde geeft meer versterking van het fotomultipliersignaal.
Met de ‘zero’-knop is het mogelijk een tegenspanning aan
te leggen waarmee het signaal dat naar de display en recorder gaat als het
ware te verschuiven, zonder dat de gevoeligheid van de meting verandert.
De ‘gain’-knop werkt niet als de functieknop op ‘absorbance’ staat.
Theorie van extinctiemetingen
Voor de meesten van jullie is de wet van Lambert-Beer reeds behandeld. Kort
samengevat zegt de wet van Lambert dat de afname (-dI) van de intensiteit
(I) van een lichtbundel door de absorptie van licht over een zeer klein stukje
van de lichtweg (dl) rechtevenredig is met de intensiteit (I) van de lichtbundel
ter plaatse. In formule -dI/dl = k*I. Daarnaast ontdekte Beer dat een
zelfde relatie opgaat voor de relatie tussen de lichtabsorptie en de concentratie
van de absorberende stof. Op elke positie in de lichtweg is de lichtabsorptie
rechtevenredig met de concentratie van de absorberende stof. In
formule -dI/dl = c*I. Gecombineerd geldt dus -dI/dl = c*k*I. Wanneer deze
differentiaalvergelijking geïntegreerd wordt van het begin van het cuvet (I =
I 0 en l = 0) tot het eind van het cuvet (l = l) wordt de volgende formule voor
de intensiteit van de lichtbundel (I) na het doorlopen van een lichtweg van 1
cm verkregen:
ln(I 0 /I) = k*c*l; I = I 0 e -k*c*l (1)
of op basis van de 10 log (lnx = logx/loge): log(I 0 /I) = log(e)*k*c*l;
I = I 0 *10 -0.4343*k*c*l (2)
I 0 = de intensiteit van de lichtbundel die binnentreedt aan het begin van het
cuvet.
I = de intensiteit van de lichtbundel nadat het licht een afstand l heeft afgelegd
in het cuvet waarbij er licht is geabsorbeerd.
0.4343*k is een molecuul afhankelijke constante en wordt de extinctie coëfficiënt
ε genoemd. De eenheid is M -1 .cm -1 .
c = de concentratie van de absorberende moleculen.
l = de weglengte van het licht door het cuvet, meestal 1 cm.
De factor ‘ε*c’ wordt de extinctie (E) of absorptie (A) van de oplossing genoemd.
De formule, I = I 0 *10 -ε*c*l , geeft de lichtintensiteit aan nadat de lichtbundel
een cuvet heeft doorlopen. Bovendien geeft de formule aan dat de lichtintensiteit
ten gevolge van lichtabsorptie exponentieel afneemt met de doorlopen
weglengte. Tevens geeft de formule aan dat log(I 0 /I) rechtevenredig is
met de concentratie van de absorberende moleculen (log(I 0 /I) = ε*c*l).
De uitvoering van een extinctiemeting
Als er een extinctiemeting wordt uitgevoerd, plaatst men eerst een cuvet
zonder het monster in de lichtweg en meet de hoeveelheid licht die op de
fotomultiplier valt (de blancometing). Deze hoeveelheid licht geeft een
- 19 -