Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

- energie afgifte door het uitzenden van licht.
- een reactie van het geactiveerde molecuul met een ander molecuul.
- het gebruiken van de energie voor de dissociatie van een binding in het
molecuul.
Als het molecuul terugvalt naar de grondtoestand onder het uitzenden
van licht noemt men dit proces fluorescentie (E = hν). De golflengte van
het uitgezonden fluorescentie licht is altijd groter dan die van het geabsorbeerde
licht. Dit komt omdat het geëxciteerde elektron (zie figuur 2.1) door
het stralingsloos terugvallen naar het laagste energieniveau van de eerste
aangeslagen toestand, energie verliest. Door het verschil in golflengte van
het excitatielicht en de fluorescentie kan men eenvoudig met een filter de
fluorescentie scheiden van het exciterende licht. Dit kan met een afkapfilter.
Dit is een filter dat licht met een kleinere golflengte (het excitatielicht) dan
de afkapgolflengte absorbeert en licht met een grotere golflengte (het fluorescentielicht)
doorlaat.
SPECTROFOTOMETRIE
Opbouw spectrofotometer
Een extinctiemeting (=kleurmeting) wordt met een spectrofotometer
uitgevoerd. De componenten waaruit zo’n apparaat is opgebouwd worden
schematisch in figuur 2.2 weergegeven.
Vanuit een lamp wordt het lamplicht een monochromator ingestuurd. In
de monochromator wordt van het lamplicht via een rooster of prisma een
spectrum gemaakt dat op de uitgangsspleet van de monochromator wordt
geprojecteerd. Omdat een rooster of prisma nooit 100% perfect is, zal het
monochromatisch licht altijd een klein tot zeer klein percentage lamplicht
bevatten. Door aan de golflengteknop te draaien schuift het spectrum langs
deze relatief smalle spleet waardoor er licht met een klein golflengtegebied
door de uitgangsspleet van de monochromator op het in de lichtweg
staand cuvet valt (sample cell). De oplossing in het cuvet absorbeert licht.
- 18 -
Figuur 2.2
Schematische voorstelling van
de opbouw van een spectrofotometer.