Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry
Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry
is tussen de hoeveelheid toegevoegd enzym en de activiteit die gemeten wordt. b. Ga al tijdens het experiment na of de activiteit rechtevenredig is met de hoeveelheid toegevoegd bladextract. Samenstelling van de verschillende buffers Extractiebuffer: 50 mM K fosfaat (pH 7.0), 1 mM EDTA, 0.1 % Triton X 100 (0.2 g / 200 mL), 10 mM DTT (dithiotreitol) (380 mg / 200 mL) Reactiebuffer: 0.1 M Tris HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.1 % Triton X 100, 1 mM DTT MUG: 10 mM 4-MethylUmbelliferyl- β-D-Glucuronzuur (MUG) Verslag over blok 1 1) Verslag over het immunoprecipitatie experiment Beantwoord de volgende vragen puntsgewijs. - Geef aan hoe je je IgG preparaat hebt gekarakteriseerd. - Geef de berekening van het percentage reagerende IgG moleculen met een hoge affiniteit. - Is de kwaliteit voldoende om het preparaat te gebruiken voor een immunoprecipitatie van een eiwitcomplex? - Geef aan welk peptide uit de SDS gel m.b.v. MALDI-TOF en MASCOT is geidentificeerd en tot welk cellulair complex dit behoort. 2) Verslag over het ELISA experiment - In het verslag moet worden aangegeven welke het percentage werkzame antilichamen in het IgG preparaat is geweest. Laat ook de grafiek zien waarmee dit percentage is berekend. - Presenteer de ijklijn en de titratie waarmee de concentratie insuline in het moster is gepaald. - Geef aan hoe je de concentratie insuline in het monster hebt berekend. 3) Verslag over het β-glucuronidase experiment Het verslag moet de elementen bevatten die in het deel van de website ‘wring a report’ worden aangegeven. In de resulataten paragraaf moeten de volgende zaken worden vermeld. - Presenteer de getallen waarmee de K M en V MAX zijn berekend. - Laat zien dat onder de door bepaalde V MAX condities de activiteit onafhankelijk is van de gebruikte hoeveelheden bladextract. - Bereken uit de fluorescentieveranderingen veroorzaakt door de verschillende hoeveelheden bladextract de β-glucuronidase activiteit per mg blad. Druk deze activiteit uit in pmol MUB gevormd . min -1 . (mg planten materiaal ) -1 - 1 -
Figuur 2.1 Quantum-mechanische voorstelling van lichtabsorptie en fluorescentie. GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMENTEN VAN BLOK 2 In de twee experimenten van blok 2 staan methoden centraal waarmee cellulaire processen en enzymen in vivo en in vitro bestudeerd kunnen worden. In het in vivo fluorescentie experiment zal ingegaan worden op enige eigenschappen van een fluorescentiemeting en zal het verschil met een absorptiemeting worden uitgelegd. Daarna zal de overgang van een aëroob naar een anaëroob metabolisme in intacte gistcellen worden bestudeerd. In het tweede experiment (computer graphics en het werkingsmechanisme van lactaat dehydrogenase) zal worden ingegaan op methoden die men gebruikt om de werking van een enzym, in dit geval lactaat dehydrogenase, te bestuderen. De activiteit van het enzym met betrekking tot de reductie van pyruvaat en oxamaat door NADH zal worden bepaald. Voorts zal met behulp van fluorescentie worden bestudeerd hoe sterk het enzym NADH bindt. Omdat de structuur van het enzym met en zonder substraten bekend is, is het mogelijk ‘te zien’ hoe substraten aan het enzym binden. Door de uitkomst van de verschillende experimenten te combineren is het mogelijk het werkingsmechanisme van een enzym op moleculair niveau te ontrafelen. Hierdoor kunnen we ons een voorstelling maken hoe enzymen als biokatalysator werken, m.a.w. hoe enzymen (eiwitten) leven mogelijk maken! THEORIEDEEL: ABSORPTIE EN FLUORESCENTIE Inleiding Lichtabsorptie en fluorescentie zijn kwantummechanische verschijnselen, vandaar dat deze fysische begrippen hier in eenvoudige termen besproken zullen worden. Wanneer een molecuul licht absorbeert, is de energie van het lichtquant gelijk is aan het verschil tussen twee energieniveaus van het molecuul. Licht in het UV- en zichtbare gebied is in staat electronen van organische moleculen met geconjugeerde bindingen of metalen met electronen in de d-orbitalen vanuit de elektronische grondtoestand naar een aangeslagen toestand te doen overgaan. De elektronische energieniveaus zijn verbreed door gesuperponeerde vibratie- en rotatie energieniveaus (figuur 2.1). Het primaire absorptieproces waarbij een elektron vanuit de elektronische grondtoestand naar een aangeslagen baan overgaat, vindt plaats in ongeveer 10 -15 s. Daarna valt het elektron binnen 10 -13 s terug naar het laagste energieniveau van de eerste aangeslagen toestand. Er zijn verschillende manieren om terug te komen in de grondtoestand. Essentieel hierbij is dat de opgenomen energie wordt afgegeven. Dit kan door: - de overdracht van een gedeelte van de energie op een ander molecuul via een botsing (warmteafgifte aan de omgeving) - 17 -
- Page 1 and 2: Basispracticum Biologische Chemie B
- Page 3 and 4: INHOUD In de colleges wordt de theo
- Page 5 and 6: ent het experiment foutloos uit te
- Page 7 and 8: GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMEN
- Page 9 and 10: Gegevens en rekenvoorbeelden Het mo
- Page 11 and 12: worden gebracht. Een methode is de
- Page 13 and 14: Vuistregels Begin met het gebruiken
- Page 15 and 16: De reactievergelijking is: MUG + H
- Page 17: Meten onder v MAX condities De Mich
- Page 21 and 22: Het restant licht valt op de fotomu
- Page 23 and 24: Figuur 2.3 Een schematische voorste
- Page 25 and 26: tage van de intensiteit van de lich
- Page 27 and 28: Figuur 2.5 Links staat het absorpti
- Page 29 and 30: wordt het signaal dat afkomstig is
- Page 31 and 32: het sequencen van DNA de aminozuurv
- Page 33 and 34: Tabel 2.1 Effect van plaatsgerichte
- Page 35 and 36: • Meet de absorptie gedurende ong
- Page 37 and 38: Computer gegenereerde getallen (mL
- Page 39 and 40: Gebruik voor de berekening van de d
- Page 41 and 42: - Het werken met het Control panel:
- Page 43 and 44: OPDRACHTEN EN VRAGEN CG EXPERIMENT
- Page 45 and 46: Figuur 2.8 De overgangstoestand voo
- Page 47 and 48: Figuur 3.1 Kristallen van natriumur
- Page 49 and 50: Figuur 3.4 De electrode reacties va
- Page 51 and 52: Figuur 3.7 Structuur van acetylacet
- Page 53 and 54: een verhoging van de GOT activiteit
- Page 55 and 56: den worden. Dit is als volgt in te
- Page 57 and 58: HANDLEIDING VOOR HET GEBRUIK VAN HE
- Page 59 and 60: - Oplossing 2 Los 0.15 g agarose M
- Page 61 and 62: Basispracticum Biologische Chemie:
- Page 63 and 64: Immunoprecipitatie en proteomics St
- Page 65 and 66: De ijking van de fluorimeter met 10
- Page 67 and 68: Fluorescence (AU) 1 0.9 0.8 0.7 0.6
Figuur 2.1<br />
Quantum-mechanische voorstelling<br />
van lichtabsorptie en fluorescentie.<br />
GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMENTEN VAN BLOK 2<br />
In de twee experimenten van blok 2 staan methoden centraal waarmee cellulaire<br />
processen en enzymen in vivo en in vitro bestudeerd kunnen worden.<br />
In het in vivo fluorescentie experiment zal ingegaan worden op enige eigenschappen<br />
van een fluorescentiemeting en zal het verschil met een absorptiemeting<br />
worden uitgelegd. Daarna zal de overgang van een aëroob naar<br />
een anaëroob metabolisme in intacte gistcellen worden bestudeerd.<br />
In het tweede experiment (computer graphics en het werkingsmechanisme<br />
van lactaat dehydrogenase) zal worden ingegaan op methoden die men<br />
gebruikt om de werking van een enzym, in dit geval lactaat dehydrogenase,<br />
te bestuderen. De activiteit van het enzym met betrekking tot de reductie<br />
van pyruvaat en oxamaat door NADH zal worden bepaald. Voorts zal met<br />
behulp van fluorescentie worden bestudeerd hoe sterk het enzym NADH<br />
bindt. Omdat de structuur van het enzym met en zonder substraten bekend<br />
is, is het mogelijk ‘te zien’ hoe substraten aan het enzym binden. Door de uitkomst<br />
van de verschillende experimenten te combineren is het mogelijk het<br />
werkingsmechanisme van een enzym op moleculair niveau te ontrafelen.<br />
Hierdoor kunnen we ons een voorstelling maken hoe enzymen als biokatalysator<br />
werken, m.a.w. hoe enzymen (eiwitten) leven mogelijk maken!<br />
THEORIEDEEL: ABSORPTIE EN FLUORESCENTIE<br />
Inleiding<br />
Lichtabsorptie en fluorescentie zijn kwantummechanische verschijnselen,<br />
vandaar dat deze fysische begrippen hier in<br />
eenvoudige termen besproken zullen worden.<br />
Wanneer een molecuul licht absorbeert, is de<br />
energie van het lichtquant gelijk is aan het verschil<br />
tussen twee energieniveaus van het molecuul.<br />
Licht in het UV- en zichtbare gebied is<br />
in staat electronen van organische moleculen<br />
met geconjugeerde bindingen of metalen met<br />
electronen in de d-orbitalen vanuit de elektronische<br />
grondtoestand naar een aangeslagen<br />
toestand te doen overgaan. De elektronische<br />
energieniveaus zijn verbreed door gesuperponeerde<br />
vibratie- en rotatie energieniveaus<br />
(figuur 2.1).<br />
Het primaire absorptieproces waarbij een<br />
elektron vanuit de elektronische grondtoestand naar een aangeslagen baan<br />
overgaat, vindt plaats in ongeveer 10 -15 s. Daarna valt het elektron binnen<br />
10 -13 s terug naar het laagste energieniveau van de eerste aangeslagen<br />
toestand. Er zijn verschillende manieren om terug te komen in de grondtoestand.<br />
Essentieel hierbij is dat de opgenomen energie wordt afgegeven. Dit<br />
kan door:<br />
- de overdracht van een gedeelte van de energie op een ander molecuul<br />
via een botsing (warmteafgifte aan de omgeving)<br />
- 17 -
Change language