Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

Meten onder v MAX condities
De Michaelis-Menten vergelijking
is: v = s * V MAX / (s + K M )
Als men onder V MAX condities
wil meten dan kiest men een
substraatconcentratie die 10
maal de K M is. Men meet dan
91% van de theoretisch haalbare
enzymactiviteit.
v = 10*K M *V MAX /(10*K M +K M )
= 10/11 * V MAX
= 0.91 * v MAX
Om 95% van de v MAX te meten
moet de substraatconcentratie
worden opgevoerd tot 18.9 maal
de K M . v = 18.9/19.9 * v MAX
Het rekenvoorbeeld geeft aan
dat het praktisch nooit mogelijk
is de v MAX te kunnen meten. Om
een paar procent meer dan de
91 % van de maximaal haalbare
activiteit te meten moet de
substraatconcentratie veel hoger
worden met het gevaar van substraatremming
en ander artifacten
zoals hoge zoutconcentraties.
Vandaar dat men kiest voor 10
* de K M als conditie om onder
v MAX condities te meten.
toevoegen dan 5 μL van een onverdunde oplossing.
- 20 μL plantenextract is een goede hoeveelheid om de substraat afhankelijkheid
van de enzymactiviteit te testen.
- Met behulp genoemde punten moet je in staat zijn een uitvoeringsprotocol
te maken.
GUS METINGEN
Er moeten een drietal experimenten uitgevoerd worden.
1) Eerst moet de fluorimeter worden gekalibreerd.
2) Vervolgens wordt er bij een vaste hoeveelheid enzym een aantal experimenten
uitgevoerd om de V MAX en K M te kunnen bepalen.
3) Als laatste wordt onder V MAX condities de activiteit bij drie verschillende
enzymconcentraties gemeten.
Overleg met je assistent over het uitvoeringsprotocol en begin daarna met
het vullen van virtuele cuvetten.
- Volg de fluorescentie in de tijd op de recorder. De gevoeligheid van de
fotomultiplier neemt direct na het begin van een meting af. Begin wel
meteen met meten maar realiseer je dat na ongeveer 1-2 minuten de gevoeligheid
stabiel is. Let dus goed op dat de activiteitsmeting niet door
dit fenomeen en ander niet-lineaire fenomenen wordt beïnvloed. Voor
een betrouwbare interpretatie van de enzymactiviteit moet de toename
van de fluorescentie enkele minuten gevolgd kunnen worden op de recorder
en moet de recordertrace een voldoende lineair stuk bevatten om
er zeker van te zijn dat de activiteitsmeting stabiel is.
- In het programma kan een raaklijn aan de curve worden getrokken. Noteer
steeds de gebruikte concentratie enzym, substraat en de gemeten
helling.
1) Het kalibreren van de fluorimeter
De gevoeligheid van de fluorimeter moet geijkt worden. Dit kan door een
interne ijking uit te voeren. Aan reactiebuffer wordt MUB (het fluorescente
product) toegevoegd. Bereken de concentratie en registreer de fluorescentie
. Test meerdere concentraties MUB.
Gebruik deze set waarnemingen om de ijkfactor voor de fluorescentiemetingen
te bereken.
2) Het bepalen van de K M , V MAX waarden
a. Test eerst bij een vaste hoeveelheid bladextract de relatie substraat en
enzymactiviteit.
b. Bepaal door een fit van de dataset (substraatconcetratie-enzymactiviteit)
aan een hyperbool de K M en V MAX waarden voor het enzympreparaat.
3. Wanneer de gegevens niet goed genoeg zijn voor een goede betrouwbare
analyse, herhaal dan enige metingen.
3) Het bepalen van de MUG activiteit van het extract onder V MAX condities
a. Nadat duidelijk is welke de V MAX condities zijn worden verschillende
enzymhoeveelheden getest om te onderzoeken of er een lineair verband
- 1 -