Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry
Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry
De door de assistent gevolgde extractie procedure Een leeg Eppendorf reactievaatje is gewogen. Een paar blaadjes zijn in het Eppendorf vaatje gedaan. Het geheel is opnieuw gewogen (ongeveer 20 mg). Per 20 mg materiaal is 100 μL extractiebuffer toegevoegd en de blaadjes zijn voorzichtig fijn gewreven in de extractiebuffer met een stamper. Dit is voorzichtig uitgevoerd omdat anders de extractievloeistof direct uit het vaatje vliegt. De celresten zijn afgedraaid in een Eppendorfcentrifuge (2 minuten centrifugeren) en het supernatant is overgebracht naar een schoon vaatje. Dit supernatant bevat de oplosbare celbestanddelen en dus ook het enzym β-glucuronidase. Het gebruik van de fluorimeter De fluorescentie zal met een virtuele MSE SpectroPlus fluorimeter worden gemeten. De excitatiegolflengte is 370 nm. Het exciterende licht wordt ontdaan van ‘witlicht’ door het primaire filter dat licht met golflengtes tussen 300 en 400 nm doorlaat. Als secundair filter wordt een Scott KV 408 afkapfilter gebruikt. Deze beide filters zijn in de cuvettenhouder aanwezig die bij het apparaat aanwezig is. Er zal in de 90° stand met 1 mL glazencuvetten worden gemeten. Zie figuur 2.4 in blok 2 en de bijbehorende tekst. Het opzetten van een activiteitsmeting Hieronder volgen een serie punten waar rekening mee gehouden moet worden op het opzetten en uitvoeren van enzymactiviteitsmetingen. Men heeft de beschikking over: - Een aantal glazencuvetten met een weglengte van 1 cm waarin men maximaal 1.2 mL vloeistof kan pipetteren. - Reactiebuffer. In deze buffer kan de activiteit van het enzym gemeten worden. - 4 mL van een geconcentreerde substraatoplossing. Deze bevat 2 mM 4 methyl umbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) in reactiebuffer. - Plantenextract. Dit is bereid zoals hierboven beschreven. 100 μL extract bevat de oplosbare celinhoud van 20 mg plantmateriaal. Schrijf op welke preparaat toebedeeld is. - Fitprogramma. Er is op de internet site van het programma een ‘fitter’ aanwezig. Via de invoer van een dataset van substraatconcentraties met de bijgehorende enzymactiviteiten worden de data gefit aan de Michaelis-Menten vergelijking. Deze fit levert een K M en V MAX waarde op. De fitdata kunnen via het clipboard worden vastgelegd en worden overgebracht naar het verslag. Randvoorwaarden - De K M waarde van β-glucuronidase (GUS) voor MUG is ongeveer 50 µM. Met behulp van kennis van de Michaelis-Menten kinetiek moet je nu in staat zijn een substraatconcentratie te kiezen waarbij het enzym een goede activiteit heeft en waarbij de activiteitsmeting min of meer onafhankelijk is van kleine variaties in de substraatconcentratie. Dit is belangrijk omdat (substraat) toevoegingen altijd enige mate van onnauwkeurigheid hebben. Daarnaast mag men geen extreem hoge substraatconcentraties toevoegen omdat MUG een kostbaar stofje is. Bovendien kunnen hoge substraatconcentraties aanleiding geven tot substraatremming. Realiseer je dat men nauwkeuriger 50 μL van een 10X verdunde oplossing kan - 14 -
Meten onder v MAX condities De Michaelis-Menten vergelijking is: v = s * V MAX / (s + K M ) Als men onder V MAX condities wil meten dan kiest men een substraatconcentratie die 10 maal de K M is. Men meet dan 91% van de theoretisch haalbare enzymactiviteit. v = 10*K M *V MAX /(10*K M +K M ) = 10/11 * V MAX = 0.91 * v MAX Om 95% van de v MAX te meten moet de substraatconcentratie worden opgevoerd tot 18.9 maal de K M . v = 18.9/19.9 * v MAX Het rekenvoorbeeld geeft aan dat het praktisch nooit mogelijk is de v MAX te kunnen meten. Om een paar procent meer dan de 91 % van de maximaal haalbare activiteit te meten moet de substraatconcentratie veel hoger worden met het gevaar van substraatremming en ander artifacten zoals hoge zoutconcentraties. Vandaar dat men kiest voor 10 * de K M als conditie om onder v MAX condities te meten. toevoegen dan 5 μL van een onverdunde oplossing. - 20 μL plantenextract is een goede hoeveelheid om de substraat afhankelijkheid van de enzymactiviteit te testen. - Met behulp genoemde punten moet je in staat zijn een uitvoeringsprotocol te maken. GUS METINGEN Er moeten een drietal experimenten uitgevoerd worden. 1) Eerst moet de fluorimeter worden gekalibreerd. 2) Vervolgens wordt er bij een vaste hoeveelheid enzym een aantal experimenten uitgevoerd om de V MAX en K M te kunnen bepalen. 3) Als laatste wordt onder V MAX condities de activiteit bij drie verschillende enzymconcentraties gemeten. Overleg met je assistent over het uitvoeringsprotocol en begin daarna met het vullen van virtuele cuvetten. - Volg de fluorescentie in de tijd op de recorder. De gevoeligheid van de fotomultiplier neemt direct na het begin van een meting af. Begin wel meteen met meten maar realiseer je dat na ongeveer 1-2 minuten de gevoeligheid stabiel is. Let dus goed op dat de activiteitsmeting niet door dit fenomeen en ander niet-lineaire fenomenen wordt beïnvloed. Voor een betrouwbare interpretatie van de enzymactiviteit moet de toename van de fluorescentie enkele minuten gevolgd kunnen worden op de recorder en moet de recordertrace een voldoende lineair stuk bevatten om er zeker van te zijn dat de activiteitsmeting stabiel is. - In het programma kan een raaklijn aan de curve worden getrokken. Noteer steeds de gebruikte concentratie enzym, substraat en de gemeten helling. 1) Het kalibreren van de fluorimeter De gevoeligheid van de fluorimeter moet geijkt worden. Dit kan door een interne ijking uit te voeren. Aan reactiebuffer wordt MUB (het fluorescente product) toegevoegd. Bereken de concentratie en registreer de fluorescentie . Test meerdere concentraties MUB. Gebruik deze set waarnemingen om de ijkfactor voor de fluorescentiemetingen te bereken. 2) Het bepalen van de K M , V MAX waarden a. Test eerst bij een vaste hoeveelheid bladextract de relatie substraat en enzymactiviteit. b. Bepaal door een fit van de dataset (substraatconcetratie-enzymactiviteit) aan een hyperbool de K M en V MAX waarden voor het enzympreparaat. 3. Wanneer de gegevens niet goed genoeg zijn voor een goede betrouwbare analyse, herhaal dan enige metingen. 3) Het bepalen van de MUG activiteit van het extract onder V MAX condities a. Nadat duidelijk is welke de V MAX condities zijn worden verschillende enzymhoeveelheden getest om te onderzoeken of er een lineair verband - 1 -
- Page 1 and 2: Basispracticum Biologische Chemie B
- Page 3 and 4: INHOUD In de colleges wordt de theo
- Page 5 and 6: ent het experiment foutloos uit te
- Page 7 and 8: GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMEN
- Page 9 and 10: Gegevens en rekenvoorbeelden Het mo
- Page 11 and 12: worden gebracht. Een methode is de
- Page 13 and 14: Vuistregels Begin met het gebruiken
- Page 15: De reactievergelijking is: MUG + H
- Page 19 and 20: Figuur 2.1 Quantum-mechanische voor
- Page 21 and 22: Het restant licht valt op de fotomu
- Page 23 and 24: Figuur 2.3 Een schematische voorste
- Page 25 and 26: tage van de intensiteit van de lich
- Page 27 and 28: Figuur 2.5 Links staat het absorpti
- Page 29 and 30: wordt het signaal dat afkomstig is
- Page 31 and 32: het sequencen van DNA de aminozuurv
- Page 33 and 34: Tabel 2.1 Effect van plaatsgerichte
- Page 35 and 36: • Meet de absorptie gedurende ong
- Page 37 and 38: Computer gegenereerde getallen (mL
- Page 39 and 40: Gebruik voor de berekening van de d
- Page 41 and 42: - Het werken met het Control panel:
- Page 43 and 44: OPDRACHTEN EN VRAGEN CG EXPERIMENT
- Page 45 and 46: Figuur 2.8 De overgangstoestand voo
- Page 47 and 48: Figuur 3.1 Kristallen van natriumur
- Page 49 and 50: Figuur 3.4 De electrode reacties va
- Page 51 and 52: Figuur 3.7 Structuur van acetylacet
- Page 53 and 54: een verhoging van de GOT activiteit
- Page 55 and 56: den worden. Dit is als volgt in te
- Page 57 and 58: HANDLEIDING VOOR HET GEBRUIK VAN HE
- Page 59 and 60: - Oplossing 2 Los 0.15 g agarose M
- Page 61 and 62: Basispracticum Biologische Chemie:
- Page 63 and 64: Immunoprecipitatie en proteomics St
- Page 65 and 66: De ijking van de fluorimeter met 10
De door de assistent gevolgde extractie procedure<br />
Een leeg Eppendorf reactievaatje is gewogen. Een paar blaadjes zijn in het<br />
Eppendorf vaatje gedaan. Het geheel is opnieuw gewogen (ongeveer 20<br />
mg). Per 20 mg materiaal is 100 μL extractiebuffer toegevoegd en de blaadjes<br />
zijn voorzichtig fijn gewreven in de extractiebuffer met een stamper. Dit<br />
is voorzichtig uitgevoerd omdat anders de extractievloeistof direct uit het<br />
vaatje vliegt. De celresten zijn afgedraaid in een Eppendorfcentrifuge (2<br />
minuten centrifugeren) en het supernatant is overgebracht naar een schoon<br />
vaatje. Dit supernatant bevat de oplosbare celbestanddelen en dus ook het<br />
enzym β-glucuronidase.<br />
Het gebruik van de fluorimeter<br />
De fluorescentie zal met een virtuele MSE SpectroPlus fluorimeter worden<br />
gemeten. De excitatiegolflengte is 370 nm. Het exciterende licht wordt<br />
ontdaan van ‘witlicht’ door het primaire filter dat licht met golflengtes tussen<br />
300 en 400 nm doorlaat. Als secundair filter wordt een Scott KV 408 afkapfilter<br />
gebruikt. Deze beide filters zijn in de cuvettenhouder aanwezig die bij het<br />
apparaat aanwezig is. Er zal in de 90° stand met 1 mL glazencuvetten worden<br />
gemeten. Zie figuur 2.4 in blok 2 en de bijbehorende tekst.<br />
Het opzetten van een activiteitsmeting<br />
Hieronder volgen een serie punten waar rekening mee gehouden moet worden<br />
op het opzetten en uitvoeren van enzymactiviteitsmetingen.<br />
Men heeft de beschikking over:<br />
- Een aantal glazencuvetten met een weglengte van 1 cm waarin men<br />
maximaal 1.2 mL vloeistof kan pipetteren.<br />
- Reactiebuffer. In deze buffer kan de activiteit van het enzym gemeten<br />
worden.<br />
- 4 mL van een geconcentreerde substraatoplossing. Deze bevat 2 mM 4<br />
methyl umbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) in reactiebuffer.<br />
- Plantenextract. Dit is bereid zoals hierboven beschreven. 100 μL extract<br />
bevat de oplosbare celinhoud van 20 mg plantmateriaal. Schrijf op welke<br />
preparaat toebedeeld is.<br />
- Fitprogramma. Er is op de internet site van het programma een ‘fitter’<br />
aanwezig. Via de invoer van een dataset van substraatconcentraties met<br />
de bijgehorende enzymactiviteiten worden de data gefit aan de Michaelis-Menten<br />
vergelijking. Deze fit levert een K M en V MAX waarde op. De<br />
fitdata kunnen via het clipboard worden vastgelegd en worden overgebracht<br />
naar het verslag.<br />
Randvoorwaarden<br />
- De K M waarde van β-glucuronidase (GUS) voor MUG is ongeveer 50 µM.<br />
Met behulp van kennis van de Michaelis-Menten kinetiek moet je nu in<br />
staat zijn een substraatconcentratie te kiezen waarbij het enzym een goede<br />
activiteit heeft en waarbij de activiteitsmeting min of meer onafhankelijk<br />
is van kleine variaties in de substraatconcentratie. Dit is belangrijk<br />
omdat (substraat) toevoegingen altijd enige mate van onnauwkeurigheid<br />
hebben. Daarnaast mag men geen extreem hoge substraatconcentraties<br />
toevoegen omdat MUG een kostbaar stofje is. Bovendien kunnen hoge<br />
substraatconcentraties aanleiding geven tot substraatremming. Realiseer<br />
je dat men nauwkeuriger 50 μL van een 10X verdunde oplossing kan<br />
- 14 -
Change language