Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

De reactievergelijking is: MUG + H 2 O MUB + Glucuronzuur
De ether (MUG) is dus niet fluorescent en de alcohol, MUB, alleen bij hogere
pH. De pKa van de 7 hydroxygroep van 4 methyl umbelliferon ligt rond pH 8,
vandaar dat de fluorescentie van MUB bij pH 8.5 wordt gemeten.
Factoren die de uitkomst van een fluorescentiemeting kunnen beïnvloeden
1) Zoals in het theoriedeel over fluorescentie is vermeld (zie blok 2), is fluorescentie
een gevoelige meetmethode, maar kan de meting beïnvloed
worden door quenching.
2) Omdat een fluorescentie meeting een absolute meting is, moet er altijd
geijkt worden met een standaard. Dit in tegenstelling tot extinctiemetingen.
De verschillen tussen een fluorescentie- en absorptiemeting
worden uitgelegd op het college en een samenvatting is terug te vinden
bij blok 2 (zie pagina 24).
3) Een activiteitsmeting moet ook door anderen elders uitgevoerd kunnen
worden. Dit betekent dat de reactieomstandigheden bekend moeten
zijn en zodanig dat deze niet afhankelijk zijn van de gebruikte enzymhoeveelheden.
Om hier zeker van te zijn moet de activiteitsmeting bij
verschillende hoeveelheden enzympreparaat worden uitgevoerd, waarbij
gecontroleerd wordt of de gemeten activiteit rechtevenredig is met
de hoeveelheid toegevoegd enzym.
4) Daarnaast heeft de te gebruiken (virtuele) fluorimeter, de SpectroPlus,
de eigenschap dat de fotomultiplier bij het warm worden, binnen 1 tot
2 minuten na het aanzetten, gevoeligheid verliest. Zonder enige verandering
in de fluorescentie daalt de uitlezing een weinig. In dit tijdvenster
kan men dus geen waarneming doen.
5) Wanneer de extractiebuffer verschilt van de reactiebuffer moet men er
op verdacht zijn dat tijdens een activiteitsmeting een enzym actiever of
inactiever wordt. Dit kan ook veroorzaakt worden wanneer de eiwitconcentratie
sterk verandert (verdunnen van een enzym, of adsorptie van
enzym aan het oppervlak van het cuvet). Dit soort processen geeft een
niet-lineair verloop van de reactie in de tijd. Het resultaat is dat de enzymactiviteit
onevenredig laag is ten opzichte van meer geconcentreerde
oplossingen. Met andere woorden de activiteitsmeting is afhankelijk van
de eiwitconcentratie.
Door kritisch naar de recordertracés te kijken (is de activiteit lineair in de tijd)
en bij verschillende hoeveelheid enzym metingen uit te voeren, kan men
er voor zorgen dat de metingen niet beïnvloed worden door de hierboven
genoemde artefacten.
Experimentele procedures en randvoorwaarden
Extractie van het enzym
De onderstaande procedure is door de assistent uitgevoerd en u ontvangt
een virtueel ‘kant en klaar’ preparaat. Het preparaat is afkomstig uit 20 mg
plantmateriaal dat met 100 μL extractiebuffer is geëxtraheerd.
- 13 -