Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

ie bevat een zogenoemd TI plasmide (Tumor Inducerend plasmide). Via dit
plasmide kan de bacterie een gedeelte van het plasmide-DNA in het DNA
van de plant inbrengen waarna de plant tumorweefsel gaat vormen. Uitgaande
van dit natuurlijk voorkomend transformatie systeem zijn vectoren
ontwikkeld waarmee elk willekeurig stuk DNA in het genoom van de meeste
planten kan worden ingebracht. Voor andere organismen, bijvoorbeeld de
mens, zijn soort gelijke vectorsystemen in ontwikkeling. Op basis van dit
soort natuurlijk voorkomende virussen zijn vectoren ontwikkeld om onder
meer gentherapie te kunnen bedrijven. Verdere informatie is te vinden in
Biochemistry 6de editie p. 157 – p. 159, 5de editie p. 163 – p. 164.
Een standaard construct voor de TI-transformatie bevat de volgende elementen:
een promotor gevolgd door de sequentie coderend voor een
(reporter)enzym gekoppeld aan het gen dat codeert voor een antibioticum
resistentie (nodig voor de selectie van de getransformeerde plantencellen).
Het geheel wordt tussen de z.g.n. ‘borders’ (ongeveer 25 baseparen per
stukje) van het TI-plasmide geplaatst. Al het DNA dat zich tussen het ‘border’-
DNA bevindt, wordt in het DNA van de plant ingebouwd. Daarnaast moeten
de genen die de eiwitten produceren die het TI-plasmide mobiliseert en
overdraagt ook in de transformerende bacterie aanwezig zijn.
Het E.coli β-glucuronidase enzym is zo geschikt om als reporterenzym te gebruiken
omdat planten een zeer lage endogene β-glucuronidase enzymactiviteit
bezitten. Tevens is het β-glucuronidase een stabiel enzym en heeft het
enzym geen cofactoren of prosthetische groepen nodig die moeten worden
ingebouwd tijdens de biosynthese van het enzym. Daarnaast is de activiteit
van het enzym gevoelig te meten.
Eigenschappen van β-glucuronidase en de activiteitsmeting
Het enzym β-glucuronidase katalyseert de hydrolyse van glucuronides. Dit
zijn ethers van D-glucuronzuur en een alcohol. In dit experiment zal de ether
van 4 Methyl-Umbelliferon (= 7 hydroxy 4 methyl-coumarine) en D-Glucuronzuur
(MUG) als substraat voor β-glucuronidase worden gebruikt. Het
hydrolyseproduct, 4 Methyl-UmBelliferon (MUB), is alleen maar fluorescent
als de 7 hydroxy groep geïoniseerd is.
- 12 -
Figuur 1.2
De reactievergelijking van de
hydrolyse van MUG en de bijbehorende
structuurformules.