Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

Vuistregels
Begin met het gebruiken van de
standaard instellingen voor de
IgG verdunningen. Verdun de
oplossing tussen de rijen 2 maal.
Neem een factor 10 tot 15
minder eiwit van het gezuiverd
Ag dan van de IgG oplossing.
De bindingsratio op eiwitbasis is
IgG-bindingsplaatsen / insuline
= 15 / 1.
De hoeveelheid niet-gelabeld
antigeen in de eerste kolom (de
minst verdunde oplossing) moet
ongeveer 100 maal meer zijn dan
de hoeveelheid gelabeld-antigeen.
Kies voor het bepalen van een
concentratie altijd een curve
waarbij een paar antigeenverdunningen
een gelijke extinctie
wordt gemeten.
Een concentratiebepaling in een
monster moet altijd worden uitgevoerd
op een plaat waarbij ook
een ijklijn aanwezig is. Kies voor
de ijklijn de kolommen 1 t/m 6 en
voor het monster 7 t/m 12.
Er is een Excel-sheet beschikbaar
waarin drie tab-bladen geschikt
gemaakt zijn om de data uit het
programma direct om te zetten in
grafieken.
Tab-blad ‘titer’ voor het bepalen
van het percentage werkzame
IgG moleculen.
Tab-blad ‘calibration curve’ voor
het maken van een ijkcurve.
Tab-blad ‘Calibration and sample
curve’. Deze is bruikbaar voor
het bepalen van de concentratie
insuline in het monster.
• De plaat wordt in een spectrofotometer doorgemeten. De gemeten
waardes variëren tussen 0 en ongeveer 2. Dit wordt met een kleurcode
weergegeven. Is er in een putje weinig of geen enzym aanwezig dan is de
kleur wit. Meer enzym geeft een toename de groenkleuring. Voorts is het
mogelijk de absorptiewaarden op te vragen.
Uitvoering
Het bepalen van het percentage werkzame IgG moleculen in het gezuiverde
IgG preparaat
Er moet worden begonnen met het bepalen van het percentage werkzame
antilichamen (Ab) in het IgGpreparaat. Hiervoor moet je weten welke de
minimale hoeveelheid Ab is waarmee je alle (gelabelde) Ag kunt binden. De
hoeveelheid gelabeld Ag kan ook gekozen worden. Soms kan het noodzakelijk
zijn de standaard hoeveelheid (10 µL 5 µg/mL) te verminderen of juist te
vergroten.
Wanneer je weet bij welke antilichaamverdunning je alle gelabelde moleculen
nog kunt verwijderen uit de oplossing, kan deze verdunning gebruikt
worden om een ijkcurve te maken. Het bereik van de assay is te vergroten
door een factor 10 meer Ab te gaan gebruiken.
Ijklijn en kwantitatieve analyse van het monster
Hierna wordt een ijklijn gemaakt. Met de gemaakte ijklijn wordt de concentratie
antigeen in het monster bepaald. Test verschillende verdunningen en
meet elke verdunning minstens in vijfvoud.
Verslag
Gebruik het progress report voor het schrijven van het verslag over dit experiment.
In het verslag moet worden aangegeven welke preparaat is getest,
wat het percentage werkzame antilichamen is geweest, de ijklijn moet worden
getoond en welke de concentratie insuline in het monster is geweest.
Aangegeven moet worden hoe de getallen berekend zijn.
β-GLUCURONIDASE ALS REPORTERENZYM VOOR GENEXPRESSIE
Doel van het experiment
Het doel van het experiment is de Michaelis-Menten parameters te bepalen
van het E. coli enzym β-glucuronidase in een plantenextract. Deze parameters
zijn nodig om de specifieke activiteit van het enzym in een transgene
plant op een wetenschappelijk verantwoordelijke manier vast te stellen. Het
enzym β-glucuronidase wordt veel gebruikt als marker voor genexpressie in
transgene planten.
Naast de theorie over het meten van de Michaelis-Menten constanten van
een enzym, zie hoofdstuk 8 Biochemistry, moet u rekening houden met
experimentele mogelijkheden en onmogelijkheden bij het opzetten, uitvoeren
van het experiment. De enzymactiviteit zal met behulp van fluorescentie
worden gemeten met een virtuele fluorimeter.
Inleiding
Een veelgebruikte methode om planten te transformeren (denk aan het
transgene soja en maïs) is gebruik maken van het transformatie systeem
zoals dit in de bacterie Agrobacterium tumefaciens aanwezig is. Deze bacte-
- 11 -