Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

deze simulatie zal het gaan om het humane insuline, een peptide hormoon.
Humaan insuline wordt tegenwoordig via de recombinant DNA technologie
in een eukaryoot systeem geproduceerd en via een aantal stappen gezuiverd.
Het gezuiverde insuline, in dit experiment het antigeen, is in drie porties
verdeeld.
• Een deel is bij een konijn ingespoten, waardoor een immuunreactie is
opgewekt. Hierdoor worden er met humaan insuline reagerende antilichamen
aangemaakt. Door wat bloed af te tappen wordt een antiserum
verkregen. Dit serum bevat antilichamen die het antigeen binden. Je
moet je hierbij realiseren dat de kwaliteit van het antiserum van konijn
tot konijn verschilt. Dit betekent dat de concentratie van de reagerende
IgG moleculen en hun affiniteit voor verschillende epitopen (IgG bindingsplaatsen)
op het antigeen verschilt. Deze twee factoren bepalen de
kwaliteit van het antilichaampreparaat en zijn dus onbekend bij het begin
van de komende simulaties.
• Een tweede deel wordt bewaard als een oplossing van 1 mg/mL. Deze oplossing
wordt gebruikt, samen met het antiserum (antilichaamoplossing),
om een ijklijn te maken.
• Het derde deel is gelabeld. In de ELISA methode is het antigeen voorzien
van een biotine-groep. Verder is een biotine bindend eiwit beschikbaar,
avidine, waaraan Horse Radish Peroxydase (HRP) is gekoppeld.
- Het labellen van het antigeen is nodig omdat er geen andere manier is om
een antilichaam-antigeen complex aan te kunnen tonen. Een hoeveelheid
enzym zoals HPR, is via een activiteitsmeting te bepalen. Hierbij wordt een
substraat omgezet in een gekleurd product.
De ImmunoLab procedure
De in het programma gevolgde procedure is de volgende:
• Er wordt 100 μL van een verdunde antilichaamoplossing in de putjes van
een 96 wells-plaat gebracht. De omstandigheden (hogere pH) zijn zo
gekozen dat eiwit aan het polystyreenoppervlak irreversibel bindt.
• Het niet-gebonden eiwit (dus ook antilichamen) wordt bij neutrale pH
weggewassen en de resterende eiwitbindingsplaatsen worden bezet met
een ander eiwit (blokkeren).
• Er wordt met biotine-gelabeld antigeen (AgB) en ongelabeld antigeen
(Ag) aan de putjes toegevoegd. Het antigeen kan binden aan de geïmmobiliseerde
antilichamen.
• Het niet gebonden materiaal wordt via wasstappen verwijderd.
• Er wordt avidine (een eiwit met een biotinebindingsplaats) met daaraan
gekoppeld HorseRadishPeroxidase toegevoegd. Het avidine bindt sterk
aan biotine, dat weer via het antigeen en de IgG moleculen aan het polystryreenoppervlak
vastzit.
• Het niet gebonden materiaal wordt weer weggewassen.
• Als laatste wordt er 100 μL substraatoplossing voor het HRP enzym
toegevoegd. De hoeveelheid gebonden enzym bepaalt de hoeveelheid
kleur die in een bepaalde tijd gevormd wordt. In de simulatie kan de
kleur niet onbeperkt toenemen. De lichtabsorptie van een putje wordt
niet groter dan 2 omdat apparatuur geen waarden boven de 2 weergeeft.
Wanneer deze waarde bereikt wordt, wordt de evenredigheid tussen
kleur en hoeveelheid enzym verbroken.
- 10 -
Algemene informatie en rekenvoorbeelden
Het molecuulgewicht van IgG =
150 kDa en dat van insuline 5 kDa.
IgG heeft 2 bindingsplaatsen dus
is dan de molaire ratio op eiwitbasis
75 kDa / 5 kDa = 15 / 1.
1 µg IgG kan maximaal 0.067 µg
insuline binden. Dit zijn 13.3 pmol
insuline bindingsplaatsen op IgG.
1 µg insuline (Ag) is 1 x 10 6 pg /
5000 (pg/pmol) = 200 pmol.
Er wordt standaard 100 µL oplossing
aan een putje toegevoegd.
De maximale bindingscapaciteit
voor eiwit is per putje 400 ng /
100 µL.
De concentratie van een IgG
oplossing moet minder zijn dan
400 (ng) / 100 (µL) = 4 (ng / µL) =
4 µg / mL.
De maximale hoeveelheid insuline
(gelabeld en ongelabeld) dat
binden kan in een putje is 5.33
pmol (0.4 µg x 13.3 pmol/µg).
De concentratie van een insuline
oplossing moet altijd minder
zijn dan 5.33 pmol/100µL = 53.3
(pmol/mL) x 5000 (pg/pmol)
= 266.5 x 10 3 pg/mL = 0.0266
µg/mL.