Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

worden gebracht. Een methode is de Matrix-Assisted Laser Desorption
Ionisation (MALDI) techniek. Een peptidepreparaat wordt samen met een
zogenoemde matrix-oplossing gemengd en dit mengsel wordt op een plaat
gebracht. Daar wordt het oplosmiddel verdampt zodat er kristallen van het
matrixmateriaal en peptiden achterblijven. De kristallen worden vervolgens
pulserend bestraald met een laser. De moleculen van de matrix-oplossing
absorberen laserlicht en worden geïoniseerd. Een deel van deze geïoniseerde
matrixmoleculen ioniseert de peptiden en deze komen in de gasfase.
Vervolgens wordt gemeten hoe lang het duurt voordat de geïoniseerde
peptiden in een massaspectrometer de detector raken (Time Of Flight). De
tijdsduur is afhankelijk van de massa van het peptide. Dit levert een tabel
met massa’s op.
Het identificeren van typsinefragmenten
De tabel met massa van de trypsinefragmenten wordt vergeleken met een
database van polypeptideketens van eiwitten die allemaal in silico geknipt
zijn met hetzelfde proteolytisch enzym en die allemaal hun eigen set van
massa’s opleveren. Deze activiteit wordt via de MASCOT-site uitgevoerd. Via
een statistische analyse kan gekeken worden met welke polypeptideketen of
ketens de aangeboden set massa’s zoveel mogelijk overeenkomen.
Gegevens die in het verslag moeten worden verwerkt
In het verslag moet worden vermeld welke peptide uit de SDS gel m.b.v.
MALDI-TOF en MASCOT is geïdentificeerd en tot welk cellulair complex dit
behoort.
ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA bepaling)
Doel van het experiment
Met behulp van het ImmunoLAB programma wordt inzicht verkregen hoe
men met antilichamen een kwantitatieve bepaling kan uit te voeren. Het is
natuurlijk ook mogelijk dit soort bepalingen praktisch uit te voeren, maar
dan moet men een protocol nauwkeurig volgen anders wordt er veelal na
een paar middagen werken geen of een onbevredigend resultaat verkregen.
Omdat de wachttijden en handelingen via een simulatie snel zijn te verrichten,
is het mogelijk zelf condities te kiezen en deze te testen. Op deze
manier wordt meer inzicht in de methode verkregen dan het volgen van een
‘kookboek’.
Principe van het experiment
Bij de ELISA assay is het immobilisatiemiddel een polystyreen plaat en
wordt een enzymatische reactie gebruikt als detectiemiddel. In de hier uit te
voeren simulatie wordt het antilichaam vastgezet aan een vast oppervlak en
wordt een competitie opgezet tussen gelabeld en ongelabeld antigeen om
een beperkte hoeveelheid bindingsplaatsen. De kwaliteit en verdunning van
het antilichaampreparaat bepaalt hier het aantal bindingsplaatsen en dus de
dynamische range van het experiment. Gebonden gelabeld antigeen wordt
zichtbaar gemaakt met behulp van een enzymreactie.
Preparaten
Voor een kwantitatieve immunoassay heb je gezuiverd antigeen nodig. In
- -