Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

witten in bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae) een GFP sequentie in te
bouwen. In dit in silico experiment wordt een van de verkregen klonen
onderzocht. De cel bevat een ingebouwd GFP gen en het fusie-eiwit wordt
geproduceerd. Het in het eerste deel van het experiment geteste gezuiverde
IgG preparaat is nu via het Fc-gedeelte covalent gekoppeld aan agarose-bolletjes.
Uitvoering
5 mL celextract wordt geïncubeerd met 25 µg IgG (17 µL gepakte agarose
beads). Na een incubatie van 1 uur bij 4 graden onder voortdurend zwenken
worden de agarose beads afgedraaid (1 min 3000 rpm). Er wordt 3 keer gewassen
met buffer. Vervolgens wordt het eiwitcomplex losgekoppeld van de
agarose-IgG bolletjes door het toevoegen van SDS. Na centrifugeren wordt
aan het supernatant β-mercaptoethanol toegevoegd. Het mengsel van
eiwitten wordt op een SDS-PA gel op grootte gescheiden in verschillende
banden. De individuele banden worden uitgesneden en behandeld met DTT,
de cysteinezijketens worden met jodoacetaat gecarboxymethyleerd en de
overmaat jodoacetaat wordt met cysteine verwijderd. Overnacht wordt het
mengsel met trypsine behandeld. Het totale volume is 50 µL. Er wordt 25 µL
gebruikt voor een MALDI-TOF experiment.
c) Het karakteriseren van de peptides.
Het bepalen van de massa’s van het trypsinedigest
Voor de massaspectroscopie is het nodig dat de moleculen in de gasfase
- -
Figuur 1.1
MALDI-TOF massa spectroscopie
1) Het eiwitmonster, omgeven door
een matrix, wordt geïoniseerd
door een pulse van de laser.
2) Een electrisch veld versnelt de
gevormde ionen door een vliegbuis
naar een detector.
3) De lichtste ionen komen het
eerst aan.
4) De ioniserende pulserende laser
start ook een klok die de vliegtijd
van de ionen meet.