Basispracticum Biologische Chemie - Biochemistry

Basispracticum Biologische Chemie
BIC-10306
Practicumhandleiding Biochemie-deel
Leerstoelgroepen:
Uitgave februari 2009
Biochemie
en
Moleculaire Biologie

Op de voorkant staat de kristalstructuur van het transacetylase enzym van het pyruvaat dehydrogenase
complex uit de bacterie Azotobacter vinelandii. Het transacetylase enzymcomplex vormt de basis voor het
pyruvaat dehydrogenase multienzymcomplex. Het multienzymcomplex bestaat uit het pyruvaat dehydrogenase,
het dihydrolipoyl transacetylase en het dihydrolipoyl dehydrogenase. De structurele integratie van
drie verschillende enzymen maakt een gecoördineerde katalyse van een complexe reactie mogelijk.
De tweede afbeelding is de structuur van het Catabolite gene Activator Protein (CAP) uit E. coli gebonden
aan DNA. Door de binding wordt de DNA helix ongeveer 90 graden gebogen. Het eiwit heeft via twee
helix-loop-helix motieven sterke interacties met het DNA via de ‘major grooves’ van de DNA dubbel helix.
Twee 43 graden knikken zorgen ervoor dat de normaal rechte DNA helix-as ongeveer 90 graden wordt gebogen.
Hierdoor wordt RNA polymerase sterker aan de promotor plaats gebonden en wordt gen expressie
gestimuleerd.

INHOUD
In de colleges wordt de theoretische achtergrond van de experimenten toegelicht, worden de experimenten besproken
en in een kader geplaatst.
In de practicumhandleiding is elk experiment voorzien van een inleiding en eventueel een stuk theorie. Vervolgens
wordt het experimentele deel beschreven. De handouts van de PowerPoint presentaties zijn aan het eind van de
handleiding toegevoegd.
Inleiding 2
Blok 1: in silico experimenten
Overzicht 5
- Immunoprecipitatie en proteomics (IP) 5
- Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 8
- β-Glucuronidase als reporterenzym voor genexpressie (GUS) 11
Verslag over de experimenten van blok 1 15
Blok 2: gebruik van (spectroscopische) technieken om biochemische systemen te bestuderen
Overzicht 17
Theoriedeel absorptie en fluorescentie 17
Experimenteel deel
(In vivo) fluorescentie (IVF) 25
Het werkingsmechanisme van lactaat dehydrogenase 53
Metingen aan lactaatdehydrogenase (LDH-1) 32
Het uitwerken van het LDH experiment (LDH-2) 35
Computer Graphics van LDH (LDH-3) 38
Verslag over de experimenten blok 2 44
Blok 3: kwantitatieve analyses met behulp van enzymen
Overzicht 45
Urinezuurbepaling (UZ) 46
Klinische enzymactiviteitsmetingen (KE) 50
Electroforese 52
Isoelectrisch focusseren met het Pharmacia PhastSystem (IEF) 55
Verslag over de experimenten blok 3 57
Handouts PowerPoints College
- -

INLEIDING
Opzet van het practicum
Het practicum bestaat uit twee delen: een theoretisch en een praktisch deel.
De theorie is toegespitst op de uit te voeren experimenten en zal in een serie
colleges behandeld worden. Naast de colleges is de theorie opgenomen in
de handleiding en soms wordt voor extra informatie verwezen naar het boek
Biochemistry.
Het praktisch deel omvat het uitvoeren van de experimenten, het (foutloos)
uitrekenen van de verkregen resultaten en en het schrijven van een verslag.
In het verslag moeten de in de handleiding gestelde vragen worden beantwoord.
De verslagen worden mits tijdig ingeleverd nagekeken en teruggegeven
zodat men goed voorbereid aan de toets kan deelnemen. Deze wordt
in de examenweek afgenomen. In deze toets zal de kennis over de in het
verslag beantwoorde vragen en het foutloos kunnen uitrekenen van experimenten
zoals ze tijdens het practicum zijn geoefend worden getest. Voorbeeldtoetsen
zijn te vinden op het Internet (biochemistry.wur.nl/pbc/index.
html).
Het Biochemisch deel van dit practicum zal worden beoordeeld aan de hand
van het verslag (deze beoordeling bepaalt het eindcijfer voor 2/3) en het resultaat
van de toets (bepaalt het eindcijfer voor 1/3). Wel is het zo dat er voor
de twee toetsen van dit vak (de biochemie- en moleculaire biologie-toets)
een bodemcijfer geldt, namelijk een 5.5!
De cijfers voor het biochemie- en het moleculair biologische deel van dit
practicum bepalen elk de helft van het eindcijfer.
Inhoud van het practicum
Tijdens dit practicum zal ervaring worden opgedaan met enige, veel gebruikte
biochemische technieken en analysemethoden en de daarbij noodzakelijke
apparatuur. Bij de keuze van de experimenten is zoveel mogelijk
geprobeerd een breed scala van experimenten aan te bieden in een vorm
zoals je ze in andere niet-biochemische disciplines kunt tegenkomen. De
technieken die je tijdens het practicum gaat oefenen en de apparatuur die je
daarbij moet bedienen zijn de volgende:
- enzymactiviteitsmetingen en kwantitatieve bepalingen met behulp van
enzymen
- spectrofotometrie en fluorimetrie
- het bepalen van de specifieke activiteit van een enzym in transgene plant
- polarografische zuurstofmetingen
- computer graphics
- isoelectrisch focusseren gevolgd door een enzymactiviteitsmeting in de
gel.
- oefenen in het opzetten en in silico uitvoeren van een kwantitatieve immunologische
bepaling en het volgen van een protocol van een immunoprecipitatie
en identificatie van polypeptideketens met massaspectroscopie
en een databasezoekactie.
Verslag
Het verslag dient te worden gemaakt om de assistent de mogelijkheid te
geven te beoordelen hoe je het experiment heeft uitgevoerd en of je in staat
- -

ent het experiment foutloos uit te rekenen. Via het beantwoorden van
vragen wordt ook getest of je de theorie achter de experimenten begrijpt.
Gezien deze randvoorwaarden worden aan het verslag de volgende eisen
gesteld:
- De resultaten van de experimenten moeten kort worden beschreven.
Dit betekent dat de gemeten waarden overzichtelijk moeten worden
gepresenteerd en dat moet worden aangegeven hoe de berekeningen
zijn gevoerd. Indien de metingen geregistreerd zijn op een recorder dan
moet het recorderpapier bij het verslag worden ingeleverd. Dit biedt de
assistent de mogelijkheid te controleren of de data juist zijn geïnterpreteerd.
Vergeet niet je naam en groepsnummer op het recorderpapier te
schrijven.
- De bij de experimenten gestelde vragen en/of opdrachten moeten
beantwoord/uitgevoerd worden. Aan de kwaliteit van de antwoorden
worden hoge eisen gesteld. Alles wordt namelijk uitgelegd op college
en tijdens het practicum. Daarnaast zijn de antwoorden op de vragen
terug te vinden in het theoretisch deel van de handleiding en in het boek
Biochemistry.
- Het verslag wordt per blok bij de assistent ingeleverd en zal met opmerkingen
worden teruggegeven.
- Om te voorkomen dat het schrijven en nakijken van de verslagen een
slepende zaak gaat worden, moet het verslag over een set experimenten
(blok) twee weken nadat het blok is afgerond worden ingeleverd.
Wanneer het verslag niet op tijd wordt ingeleverd kan een één voor het
betreffende blok gegeven worden.
Toets
Naast de kwaliteit van de verslagen wordt getoetst of je de theorie die ten
grondslag ligt aan het praktisch gedeelte beheerst en of je in staat bent zelfstandig
uitgevoerde experimenten uit te rekenen. Voor de toets geldt een
bodemcijfer van 5.5. Een bodemcijfer wordt toegepast omdat het beheersen
van de theorie en het kunnen uitrekenen van experimenten een essentieel
onderdeel van het practicum is. Wat heeft het voor zin om een experiment
uit te voeren als je niet in staat bent het experiment foutloos te kunnen uitrekenen?
De toets bestaat uit 10 theorievragen en 4 rekenvraagstukken. De
telling is zodanig dat je een voldoende hebt als je 8 van de 10 theorievragen
fout hebt en alle sommen goed of 50% van de sommen en 2 theorievragen
fout hebt beantwoord. Op de internetpagina van dit vak staat minimaal 4
toetsen. De internetpagina is: biochemistry.wur.nl/pcb/index.html
Bepalen van het eindcijfer
Voor het bepalen van het eindcijfer gelden de volgende regels. Het vak is
opgesplitst in een Biochemiedeel en een Moleculaire Biologiedeel. Elk deel
is weer opgesplitst in subdelen waaronder een toets. Het berekenen van een
cijfer wordt via een gewogen middeling uitgevoerd, met dien verstande dat
voor de beide toetsen een voldoende is gehaald (≥ 5.5). Het Biochemiedeel
bevat een toets (telt voor 1/3) en een verslagdeel (telt voor 2/3). De waardering
voor het Moleculaire Biologiedeel komt tot stand door de cijfers voor
het practicumverslag, de praktische vaardigheid en inzet, en de toets te middelen.
Wanneer voor een van de toetsen een cijfer van 4.5 tot 5.4 wordt gehaald,
- -

terwijl voor de andere onderdelen wel een voldoende is gehaald, wordt een 5
als eindresultaat doorgegeven. Wanneer voor één van de toetsen een cijfer lager
dan 4.5 wordt gehaald, terwijl voor de andere onderdelen wel een voldoende
is gehaald, wordt dit cijfer als eindresultaat voor het vak doorgegeven. Indien
voor beide toetsen een cijfer lager dan 4.5 wordt behaald, terwijl voor de andere
onderdelen wel een voldoende is gehaald, wordt het gewogen gemiddelde van
beide toetsen doorgegeven.
De resultaten behaald voor de verschillende onderdelen zijn terug te vinden op
de blackboard site van deze cursus en op het prikbord bij Biochemie.
Orde, netheid en aanwezigheid
Om een groep mensen in een beperkte ruimte goed te kunnen laten werken, zal
er enige discipline moeten heersen. Dit is vooral belangrijk wanneer er nauwkeurig
moet worden gewerkt, zoals op dit practicum. Er wordt van je verwacht
dat alle flessen, buizen met oplossingen en incubaties worden voorzien van een
opschrift. Cuvetten en Eppendorf reactievaatjes horen thuis in hun respectievelijke
houders. Schone pipettipjes worden altijd in bak bewaard en nooit los op
tafel neergelegd. Opgeloste giftige chemicaliën worden niet door de gootsteen
weggegooid maar in afvalvaten opgeslagen. Gebruikt glaswerk wordt met water
omgespoeld en in de afwasbakken neergezet. Gemorst water of gemorste oplossingen
worden onmiddellijk met papier opgenomen. Kledingstukken, tassen en
overtollig papier worden niet op de werktafels of op de grond neergelegd. Wanneer
je klaar bent met het experimentele werk wordt de werkplek opgeruimd.
In verband met de giftigheid van sommige chemicaliën kan eten en drinken
tijdens het werk aan de laboratoriumtafels niet worden toegestaan.
De colleges beginnen om 13.30 uur en op alle andere dagen wordt je geacht
‘s middags voor 13.30 uur op de practicumzaal aanwezig te zijn. Wanneer je
verhinderd bent, wordt van je verwacht dat je je afmeldt bij het secretariaat van
de leerstoelgroepgroep, tel: 0317-482868. In overleg met de practicumleiding
wordt bepaald wanneer je de experimenten inhaalt.
Indeling van de experimenten
Het practicum is onderverdeeld in drie blokken. De eerste en tweede dag zijn er
college’s. Op de tweede dag, na het college wordt op de practicumzaal door de
assistent een inleiding over de komende experimenten gegeven. Op de derde
middag wordt er met het experimenteel werk begonnen. Er zijn gedurende het
practicum twee middagen geroosterd die gebruikt kunnen worden om experimenten
in te halen, om experimenten uit te werken en om verslagen te schrijven.
Blok 1: in silico experimenten
Immunoprecipitatie, ELISA en β-glucuronidase
Blok 2: Gebruik van (spectroscopische) technieken om biochemische systemen
te bestuderen
(In vivo) Fluorescentie
Lactaat dehydrogenase
Blok 3: Kwantitatieve analyses met behulp van enzymen
Urinezuurbepaling
Klinische enzymactiviteitsmetingen
Isoelectrisch focusseren
- -

GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMENTEN VAN BLOK 1
Blok 1 bevat oefeningen in technieken waarmee eiwitten, eiwitcomplexen en
enzymen kunnen worden aangetoond en gekarakteriseerd. De technieken
zijn een immunoprecipitatie gevolgd door een identificatie van de geprecipiteerde
polypeptiden (Immunoprecipitatie en proteomics), een ‘Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay’, ELISA (het bepalen van een hormoonconcentratie) en
het bepalen van de specifieke activiteit van een enzym in een celextract (βglucuronidase
als reporterenzym voor genexpressie). Bij de drie experimenten
in dit blok is de apparatuur vervangen door een computerprogramma. Dit wil
zeggen dat het computerprogramma moet worden voorzien van invoer (het
vullen van een cuvet, ‘epje’ of ELISA plaat), vervolgens genereert het programma
data die moeten worden verwerkt op dezelfde manier alsof er van een normaal
apparaat gebruik werd gemaakt. De computerprogramma’s behoeden je
niet voor fouten. Er geldt dus ‘rubbish in, rubbish out’.
Inleiding: immunologie levert technieken om eiwitten te onderzoeken
Immunologische methoden zijn belangrijk gereedschappen om eiwitten te
zuiveren, kwantitatief te bepalen en te lokaliseren in de cel. Alle technieken
maken gebruik van de specificiteit van antilichamen voor hun doelmoleculen.
Een antilichaam (wordt ook immunoglobuline, IgG, genoemd) is een eiwit
dat in een dier wordt gemaakt in een reactie op de aanwezigheid van een
lichaamsvreemde stof, het antigeen. Dit kunnen eiwitten, koolhydraten en
nucleinezuren zijn. Een antilichaam herkent (= bindt sterk aan) een groep of
een cluster van aminozuurzijketens van het antigeen. De bindingsplaats wordt
epitoop genoemd.
Door de mogelijkheid van automatiseren wordt bijvoorbeeld de ELISA techniek
grootschalig toegepast. Enige voorbeelden van de toepassing van ELISAbepalingen
in de klinische biochemie zijn het bepalen van de bloedgroepfactor
of een kwantitatieve insuline of oestrogeen bepaling. Het aantonen van de
veroorzakers van infectieziekten zoals het rode hondvirus, salmonella bacteriën,
schimmels zoals Aspergillus en parasieten zoals trypanosomen.
De meest bekende ELISA toepassing is momenteel wel het aantonen van
het AIDS veroorzakende retrovirus, Human Immunodeficiency Virus, (HIV) in
bloedcellen. Het HIV virus heeft manteleiwitten die uniek zijn voor dit virus
en niet in andere humane retrovirussen wordt aangetroffen. Antilichamen die
zijn opgewekt tegen de manteleiwitten worden gebruikt om een besmetting
met het virus aan te tonen. Het gebruik van antilichamen bij de detectie van
eiwitten is op college behandeld en achtergrondinformatie is terug te vinden
in Biochemistry, Berg et al. 6 de editie hoofdstuk 3.3 ‘Immunology provides
important techniques with which to investigate proteins’, p. 84– 90; 5 de druk
4.3: p. 98-103.
Immunoprecipitatie en proteomics
Doel van het experiment
Het doel van het experiment is via een simulatieprogramma inzicht te krijgen
in de procedures waarmee men een immunoprecipitatie uitvoert en op welke
manier het geprecipiteerde complex wordt gekarakteriseerd. Dit gaat met
behulp van electroforese, massaspectrometrie en een databasezoekactie.
- -

Samenvatting van het experiment
1) Het karakteriseren van een te gebruiken IgG preparaat en het koppelen
van IgG moleculen aan agarose beads.
2) Precipiteren van een antigeencomplex met IgG-agarose beads. Niet-specifiek
gebonden eiwitten via wasstappen verwijderen.
3) Loskoppelen van een antigeencomplex van IgG-agarose beads met behulp
van SDS.
4) Het gezuiverde complex scheiden in polypeptideketens via SDS-PAGE.
5) Individuele banden uit een SDS-gel snijden, disulfidebindingen reduceren,
de S-H groepen carboxymethyleren en de polypetideketen splitsen
met trypsine.
6) De massa van de trypsinefragmenten bepalen met MALDI-TOF.
7) Het vergelijken van de massa’s van de peptides met een peptidedatabase.
Eiwitten in de database zijn in silico geknipt en de massa van de peptidefragmenten
is berekend. Het te identificeren trypsinedigest wordt
vergeleken met alle trypsinedigesties uit de database. Na een statistische
analyse worden mogelijke overeenkomsten in een resultaattabel samengevat.
8) Na het identificeren van alle bandjes uit de SDS gel is het mogelijk na te
gaan welke polypeptideketens in het eiwitcomplex geprecipiteerd zijn en
mogelijk een structureel complex in de cel vormen.
Bovenstaande stappen moeten via de drie hoofdmenuitems in het programma
‘Immunoprecipitatie en Proteomics ‘ worden uitgevoerd. De hoofdmenuitems
zijn:
a) Het karakteriseren van het IgG preparaat (‘Characterization IgG’).
b) Het uitvoeren van een immunoprecipitatie en het bereiden van een trypsine
digestie (‘Isolation of Protein Complex’).
c) Het karakteriseren van het trypsine-digest met behulp van massaspectrometrie
en een databasezoekactie (‘Characterization of Peptides’).
Na het karakeriseren van het IgG preparaat wordt besloten of de concentratie
werkzame IgG moleculen hoog genoeg is om een succesvolle immunoprecipitatie
uit te kunnen voeren. Wanneer deze lager is dan 1% dan zal
er een nieuw preparaat moeten worden getest. Door een te lage werkzame
concentratie IgG moleculen moet er voor de immunoprecipitatie meer agarose
worden toegevoegd. Dit verhoogt de niet-specifieke adsorptie aan de
agarose zelf en ook de kans dat er eiwitten worden gebonden aan de nietspecifieke
IgG moleculen. Deze niet-specifieke co-precipitatie vertroebelt
de uitkomst van het experiment en kan zelfs een geheel onjuist antwoord
geven.
Wanneer de concentratie werkzame IgG moleculen groter is dan 1% kan
verder gegaan worden in het programma. Aan het eind van het experiment
moet je in staat zijn aan te kunnen geven welk complex er geprecipiteerd is.
Daarna wordt aangegeven uit welke componenten het compelx bestaat.
De uit te voeren activiteiten
In het programma ‘Immunoprecipitation and proteomics’ moeten, na het
openen van het startmenu waarbij een serum wordt toegewezen, drie
hoofdactiviteiten worden uitgevoerd.
- -

Gegevens en rekenvoorbeelden
Het molecuulgewicht van IgG =
150 kDa en dat van GFP 26.9 kDa.
IgG 5 mg/mL
5 (g/L) / 150 000 (g/mol) = 33.33
x 10 -6 mol/L = 33.33 µM. Deze
concentratie bevat 66.66 µM bindingsplaatsen
voor een antigeen.
Voor GFP geldt eenzelfde berekening.
5 mg/mL = 5 (g/L) / 269 00
(g/mol) = 185.9 µM
1 µg IgG kan maximaal 13.3 pmol
antigeen binden. De berekening
is alsvogt. Ga uit van 5 µg IgG/µL.
Dit is 33.33 µM. 1 µg bevat dan
33.33/5 x 10 -6 µmol = 6.67 x 10 -
12 mol = 6.67 pmol. Het aantal
bindingsplaatsen is dan twee
maal zo groot, 13.33 pmol.
Voor GFP is de berekening
gelijk. 1 µg GFP = 37.2 pmol GFP
(185.9/5 = 37.2).
De ratio van complexvorming
tussen IgG en GFP op basis van
µg is: IgG (µg) / GFP (µg) = 1/2.79
(mol/mol)
a) Het karakteriseren van het antilichaampreparaat (IgG preparaat)
Om een immunoprecipitatie uit te kunnen voeren is er een antilichaampreparaat
nodig met een voldoende hoge antigeenbindingsaffiniteit en concentratie
van de reagerende IgG moleculen. Dit betekent dat het percentage
IgG moleculen met een hoge bindingsaffiniteit voor het antigeen hoog moet
zijn. Bij voorkeur meer dan 20%. Dit is de eerste vereiste voor een succesvolle
immunoprecpitatie.
In deze simulatie worden antilichamen gebruikt tegen GFP. GFP staat voor
Green Fluorescent Protein. Dit eiwit heeft een zeer hoge fluorescentie en is
hierdoor eenvoudig met fluorescentie te detecteren.
Het protocol voor de bereiding van een goed gedefinieerd antilichaampreparaat
is als volgt. Men immuniseert een konijn met GFP. Men tapt bloed af
en uit het serum wordt de IgG fractie gezuiverd. Deze wordt getest op de
concentratie en affiniteit van de bindende IgG’s. De concentratie en ‘bruikbare’
affiniteit kan eenvoudig worden getetst door te bepalen welke het percentage
reagerende IgG moleculen is nadat het protocol met precipitatie en
wasstappen doorlopen is. Als de bindingsaffineit voldoende is dan zal men
niet te veel antigeen te verliezen tijdens de wasstappen (= het verwijderen
van niet-specifiek gebonden eiwitten).
Protocol voor een immuunreactie tussen GFP en IgG.
In een Eppendorf reactievaatje wordt buffer gemengd met 5 µL gezuiverd
GFP (1 µg/mL bijvoorbeeld) en 20 µL van een verdunde IgG oplossing (50
µg/mL). In opeenvolgende incubaties wordt de concentratie GFP steeds
meer opgevoerd. Na een reactie van 1 uur worden aan de incubatie agarose
bolletjes toegevoegd. Deze bolletjes zijn voorzien van Protein A. Dit eiwit
bindt aan het Fc-gedeelte van IgG moleculen. Er kan maximaal 1 µg IgG per
incubatie gebonden worden. Na een reactietijd van 1 uur worden agarose
bolletjes met de gebonden IgG-GFP moleculen afgedraaid en wordt de
concentratie van (het niet-gebonden) GFP in het supernatant met behulp
van fluorescentie correlation spectroscopie (FCS) gemeten. Een concentratie
1 pg/mL GFP kan nog gemeten worden. Tot een concentratie van 10 μg/mL
is het fluorescentiesignaal rechtevenredig met de concentratie. Voor deze
metingen is slechts 200 µL oplossing vereist.
Met behulp van deze technieken is het mogelijk de bindingscapaciteit van
het IgG preparaat voor GFP moleculen te bepalen. De bindingscapaciteit
moet worden uitgedrukt in een mol-ratio: hoeveel mol GFP kan per mol IgG
gebonden worden. Vervolgens kan worden berekend hoeveel procent van
de IgG moleculen reageert met GFP.
Gegevens nodig voor het schrijven van het verslag
Gebruik het progress report dat in het programma gemaakt wordt om in het
verslag aan te geven hoe je het IgG preparaat hebt gekarakteriseerd en of de
kwaliteit voldoende is gebleken om het preparaat te gebruiken voor een immunoprecipitatie
van een eiwitcomplex. Voor de berekeningen zijn de molecuulgewichten
van GFP en IgG van belang. Deze zijn 26.9 kDa en 150 kDa
respectivelijk. Een oplossing van 5 mg/mL GFP bevat 185.9 μM GFP. Realiseer
je dat IgG 2 bindingsplaatsen voor een antigeen heeft. Een oplossing van 5
mg/mL kan dus 66.67 μM antigeen binden.
b) Protocol voor een immunoprecipitatie
In een serie genetische experimenten is getracht C-terminaal van alle ei-
- -

witten in bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae) een GFP sequentie in te
bouwen. In dit in silico experiment wordt een van de verkregen klonen
onderzocht. De cel bevat een ingebouwd GFP gen en het fusie-eiwit wordt
geproduceerd. Het in het eerste deel van het experiment geteste gezuiverde
IgG preparaat is nu via het Fc-gedeelte covalent gekoppeld aan agarose-bolletjes.
Uitvoering
5 mL celextract wordt geïncubeerd met 25 µg IgG (17 µL gepakte agarose
beads). Na een incubatie van 1 uur bij 4 graden onder voortdurend zwenken
worden de agarose beads afgedraaid (1 min 3000 rpm). Er wordt 3 keer gewassen
met buffer. Vervolgens wordt het eiwitcomplex losgekoppeld van de
agarose-IgG bolletjes door het toevoegen van SDS. Na centrifugeren wordt
aan het supernatant β-mercaptoethanol toegevoegd. Het mengsel van
eiwitten wordt op een SDS-PA gel op grootte gescheiden in verschillende
banden. De individuele banden worden uitgesneden en behandeld met DTT,
de cysteinezijketens worden met jodoacetaat gecarboxymethyleerd en de
overmaat jodoacetaat wordt met cysteine verwijderd. Overnacht wordt het
mengsel met trypsine behandeld. Het totale volume is 50 µL. Er wordt 25 µL
gebruikt voor een MALDI-TOF experiment.
c) Het karakteriseren van de peptides.
Het bepalen van de massa’s van het trypsinedigest
Voor de massaspectroscopie is het nodig dat de moleculen in de gasfase
- -
Figuur 1.1
MALDI-TOF massa spectroscopie
1) Het eiwitmonster, omgeven door
een matrix, wordt geïoniseerd
door een pulse van de laser.
2) Een electrisch veld versnelt de
gevormde ionen door een vliegbuis
naar een detector.
3) De lichtste ionen komen het
eerst aan.
4) De ioniserende pulserende laser
start ook een klok die de vliegtijd
van de ionen meet.

worden gebracht. Een methode is de Matrix-Assisted Laser Desorption
Ionisation (MALDI) techniek. Een peptidepreparaat wordt samen met een
zogenoemde matrix-oplossing gemengd en dit mengsel wordt op een plaat
gebracht. Daar wordt het oplosmiddel verdampt zodat er kristallen van het
matrixmateriaal en peptiden achterblijven. De kristallen worden vervolgens
pulserend bestraald met een laser. De moleculen van de matrix-oplossing
absorberen laserlicht en worden geïoniseerd. Een deel van deze geïoniseerde
matrixmoleculen ioniseert de peptiden en deze komen in de gasfase.
Vervolgens wordt gemeten hoe lang het duurt voordat de geïoniseerde
peptiden in een massaspectrometer de detector raken (Time Of Flight). De
tijdsduur is afhankelijk van de massa van het peptide. Dit levert een tabel
met massa’s op.
Het identificeren van typsinefragmenten
De tabel met massa van de trypsinefragmenten wordt vergeleken met een
database van polypeptideketens van eiwitten die allemaal in silico geknipt
zijn met hetzelfde proteolytisch enzym en die allemaal hun eigen set van
massa’s opleveren. Deze activiteit wordt via de MASCOT-site uitgevoerd. Via
een statistische analyse kan gekeken worden met welke polypeptideketen of
ketens de aangeboden set massa’s zoveel mogelijk overeenkomen.
Gegevens die in het verslag moeten worden verwerkt
In het verslag moet worden vermeld welke peptide uit de SDS gel m.b.v.
MALDI-TOF en MASCOT is geïdentificeerd en tot welk cellulair complex dit
behoort.
ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA bepaling)
Doel van het experiment
Met behulp van het ImmunoLAB programma wordt inzicht verkregen hoe
men met antilichamen een kwantitatieve bepaling kan uit te voeren. Het is
natuurlijk ook mogelijk dit soort bepalingen praktisch uit te voeren, maar
dan moet men een protocol nauwkeurig volgen anders wordt er veelal na
een paar middagen werken geen of een onbevredigend resultaat verkregen.
Omdat de wachttijden en handelingen via een simulatie snel zijn te verrichten,
is het mogelijk zelf condities te kiezen en deze te testen. Op deze
manier wordt meer inzicht in de methode verkregen dan het volgen van een
‘kookboek’.
Principe van het experiment
Bij de ELISA assay is het immobilisatiemiddel een polystyreen plaat en
wordt een enzymatische reactie gebruikt als detectiemiddel. In de hier uit te
voeren simulatie wordt het antilichaam vastgezet aan een vast oppervlak en
wordt een competitie opgezet tussen gelabeld en ongelabeld antigeen om
een beperkte hoeveelheid bindingsplaatsen. De kwaliteit en verdunning van
het antilichaampreparaat bepaalt hier het aantal bindingsplaatsen en dus de
dynamische range van het experiment. Gebonden gelabeld antigeen wordt
zichtbaar gemaakt met behulp van een enzymreactie.
Preparaten
Voor een kwantitatieve immunoassay heb je gezuiverd antigeen nodig. In
- -

deze simulatie zal het gaan om het humane insuline, een peptide hormoon.
Humaan insuline wordt tegenwoordig via de recombinant DNA technologie
in een eukaryoot systeem geproduceerd en via een aantal stappen gezuiverd.
Het gezuiverde insuline, in dit experiment het antigeen, is in drie porties
verdeeld.
• Een deel is bij een konijn ingespoten, waardoor een immuunreactie is
opgewekt. Hierdoor worden er met humaan insuline reagerende antilichamen
aangemaakt. Door wat bloed af te tappen wordt een antiserum
verkregen. Dit serum bevat antilichamen die het antigeen binden. Je
moet je hierbij realiseren dat de kwaliteit van het antiserum van konijn
tot konijn verschilt. Dit betekent dat de concentratie van de reagerende
IgG moleculen en hun affiniteit voor verschillende epitopen (IgG bindingsplaatsen)
op het antigeen verschilt. Deze twee factoren bepalen de
kwaliteit van het antilichaampreparaat en zijn dus onbekend bij het begin
van de komende simulaties.
• Een tweede deel wordt bewaard als een oplossing van 1 mg/mL. Deze oplossing
wordt gebruikt, samen met het antiserum (antilichaamoplossing),
om een ijklijn te maken.
• Het derde deel is gelabeld. In de ELISA methode is het antigeen voorzien
van een biotine-groep. Verder is een biotine bindend eiwit beschikbaar,
avidine, waaraan Horse Radish Peroxydase (HRP) is gekoppeld.
- Het labellen van het antigeen is nodig omdat er geen andere manier is om
een antilichaam-antigeen complex aan te kunnen tonen. Een hoeveelheid
enzym zoals HPR, is via een activiteitsmeting te bepalen. Hierbij wordt een
substraat omgezet in een gekleurd product.
De ImmunoLab procedure
De in het programma gevolgde procedure is de volgende:
• Er wordt 100 μL van een verdunde antilichaamoplossing in de putjes van
een 96 wells-plaat gebracht. De omstandigheden (hogere pH) zijn zo
gekozen dat eiwit aan het polystyreenoppervlak irreversibel bindt.
• Het niet-gebonden eiwit (dus ook antilichamen) wordt bij neutrale pH
weggewassen en de resterende eiwitbindingsplaatsen worden bezet met
een ander eiwit (blokkeren).
• Er wordt met biotine-gelabeld antigeen (AgB) en ongelabeld antigeen
(Ag) aan de putjes toegevoegd. Het antigeen kan binden aan de geïmmobiliseerde
antilichamen.
• Het niet gebonden materiaal wordt via wasstappen verwijderd.
• Er wordt avidine (een eiwit met een biotinebindingsplaats) met daaraan
gekoppeld HorseRadishPeroxidase toegevoegd. Het avidine bindt sterk
aan biotine, dat weer via het antigeen en de IgG moleculen aan het polystryreenoppervlak
vastzit.
• Het niet gebonden materiaal wordt weer weggewassen.
• Als laatste wordt er 100 μL substraatoplossing voor het HRP enzym
toegevoegd. De hoeveelheid gebonden enzym bepaalt de hoeveelheid
kleur die in een bepaalde tijd gevormd wordt. In de simulatie kan de
kleur niet onbeperkt toenemen. De lichtabsorptie van een putje wordt
niet groter dan 2 omdat apparatuur geen waarden boven de 2 weergeeft.
Wanneer deze waarde bereikt wordt, wordt de evenredigheid tussen
kleur en hoeveelheid enzym verbroken.
- 10 -
Algemene informatie en rekenvoorbeelden
Het molecuulgewicht van IgG =
150 kDa en dat van insuline 5 kDa.
IgG heeft 2 bindingsplaatsen dus
is dan de molaire ratio op eiwitbasis
75 kDa / 5 kDa = 15 / 1.
1 µg IgG kan maximaal 0.067 µg
insuline binden. Dit zijn 13.3 pmol
insuline bindingsplaatsen op IgG.
1 µg insuline (Ag) is 1 x 10 6 pg /
5000 (pg/pmol) = 200 pmol.
Er wordt standaard 100 µL oplossing
aan een putje toegevoegd.
De maximale bindingscapaciteit
voor eiwit is per putje 400 ng /
100 µL.
De concentratie van een IgG
oplossing moet minder zijn dan
400 (ng) / 100 (µL) = 4 (ng / µL) =
4 µg / mL.
De maximale hoeveelheid insuline
(gelabeld en ongelabeld) dat
binden kan in een putje is 5.33
pmol (0.4 µg x 13.3 pmol/µg).
De concentratie van een insuline
oplossing moet altijd minder
zijn dan 5.33 pmol/100µL = 53.3
(pmol/mL) x 5000 (pg/pmol)
= 266.5 x 10 3 pg/mL = 0.0266
µg/mL.

Vuistregels
Begin met het gebruiken van de
standaard instellingen voor de
IgG verdunningen. Verdun de
oplossing tussen de rijen 2 maal.
Neem een factor 10 tot 15
minder eiwit van het gezuiverd
Ag dan van de IgG oplossing.
De bindingsratio op eiwitbasis is
IgG-bindingsplaatsen / insuline
= 15 / 1.
De hoeveelheid niet-gelabeld
antigeen in de eerste kolom (de
minst verdunde oplossing) moet
ongeveer 100 maal meer zijn dan
de hoeveelheid gelabeld-antigeen.
Kies voor het bepalen van een
concentratie altijd een curve
waarbij een paar antigeenverdunningen
een gelijke extinctie
wordt gemeten.
Een concentratiebepaling in een
monster moet altijd worden uitgevoerd
op een plaat waarbij ook
een ijklijn aanwezig is. Kies voor
de ijklijn de kolommen 1 t/m 6 en
voor het monster 7 t/m 12.
Er is een Excel-sheet beschikbaar
waarin drie tab-bladen geschikt
gemaakt zijn om de data uit het
programma direct om te zetten in
grafieken.
Tab-blad ‘titer’ voor het bepalen
van het percentage werkzame
IgG moleculen.
Tab-blad ‘calibration curve’ voor
het maken van een ijkcurve.
Tab-blad ‘Calibration and sample
curve’. Deze is bruikbaar voor
het bepalen van de concentratie
insuline in het monster.
• De plaat wordt in een spectrofotometer doorgemeten. De gemeten
waardes variëren tussen 0 en ongeveer 2. Dit wordt met een kleurcode
weergegeven. Is er in een putje weinig of geen enzym aanwezig dan is de
kleur wit. Meer enzym geeft een toename de groenkleuring. Voorts is het
mogelijk de absorptiewaarden op te vragen.
Uitvoering
Het bepalen van het percentage werkzame IgG moleculen in het gezuiverde
IgG preparaat
Er moet worden begonnen met het bepalen van het percentage werkzame
antilichamen (Ab) in het IgGpreparaat. Hiervoor moet je weten welke de
minimale hoeveelheid Ab is waarmee je alle (gelabelde) Ag kunt binden. De
hoeveelheid gelabeld Ag kan ook gekozen worden. Soms kan het noodzakelijk
zijn de standaard hoeveelheid (10 µL 5 µg/mL) te verminderen of juist te
vergroten.
Wanneer je weet bij welke antilichaamverdunning je alle gelabelde moleculen
nog kunt verwijderen uit de oplossing, kan deze verdunning gebruikt
worden om een ijkcurve te maken. Het bereik van de assay is te vergroten
door een factor 10 meer Ab te gaan gebruiken.
Ijklijn en kwantitatieve analyse van het monster
Hierna wordt een ijklijn gemaakt. Met de gemaakte ijklijn wordt de concentratie
antigeen in het monster bepaald. Test verschillende verdunningen en
meet elke verdunning minstens in vijfvoud.
Verslag
Gebruik het progress report voor het schrijven van het verslag over dit experiment.
In het verslag moet worden aangegeven welke preparaat is getest,
wat het percentage werkzame antilichamen is geweest, de ijklijn moet worden
getoond en welke de concentratie insuline in het monster is geweest.
Aangegeven moet worden hoe de getallen berekend zijn.
β-GLUCURONIDASE ALS REPORTERENZYM VOOR GENEXPRESSIE
Doel van het experiment
Het doel van het experiment is de Michaelis-Menten parameters te bepalen
van het E. coli enzym β-glucuronidase in een plantenextract. Deze parameters
zijn nodig om de specifieke activiteit van het enzym in een transgene
plant op een wetenschappelijk verantwoordelijke manier vast te stellen. Het
enzym β-glucuronidase wordt veel gebruikt als marker voor genexpressie in
transgene planten.
Naast de theorie over het meten van de Michaelis-Menten constanten van
een enzym, zie hoofdstuk 8 Biochemistry, moet u rekening houden met
experimentele mogelijkheden en onmogelijkheden bij het opzetten, uitvoeren
van het experiment. De enzymactiviteit zal met behulp van fluorescentie
worden gemeten met een virtuele fluorimeter.
Inleiding
Een veelgebruikte methode om planten te transformeren (denk aan het
transgene soja en maïs) is gebruik maken van het transformatie systeem
zoals dit in de bacterie Agrobacterium tumefaciens aanwezig is. Deze bacte-
- 11 -

ie bevat een zogenoemd TI plasmide (Tumor Inducerend plasmide). Via dit
plasmide kan de bacterie een gedeelte van het plasmide-DNA in het DNA
van de plant inbrengen waarna de plant tumorweefsel gaat vormen. Uitgaande
van dit natuurlijk voorkomend transformatie systeem zijn vectoren
ontwikkeld waarmee elk willekeurig stuk DNA in het genoom van de meeste
planten kan worden ingebracht. Voor andere organismen, bijvoorbeeld de
mens, zijn soort gelijke vectorsystemen in ontwikkeling. Op basis van dit
soort natuurlijk voorkomende virussen zijn vectoren ontwikkeld om onder
meer gentherapie te kunnen bedrijven. Verdere informatie is te vinden in
Biochemistry 6de editie p. 157 – p. 159, 5de editie p. 163 – p. 164.
Een standaard construct voor de TI-transformatie bevat de volgende elementen:
een promotor gevolgd door de sequentie coderend voor een
(reporter)enzym gekoppeld aan het gen dat codeert voor een antibioticum
resistentie (nodig voor de selectie van de getransformeerde plantencellen).
Het geheel wordt tussen de z.g.n. ‘borders’ (ongeveer 25 baseparen per
stukje) van het TI-plasmide geplaatst. Al het DNA dat zich tussen het ‘border’-
DNA bevindt, wordt in het DNA van de plant ingebouwd. Daarnaast moeten
de genen die de eiwitten produceren die het TI-plasmide mobiliseert en
overdraagt ook in de transformerende bacterie aanwezig zijn.
Het E.coli β-glucuronidase enzym is zo geschikt om als reporterenzym te gebruiken
omdat planten een zeer lage endogene β-glucuronidase enzymactiviteit
bezitten. Tevens is het β-glucuronidase een stabiel enzym en heeft het
enzym geen cofactoren of prosthetische groepen nodig die moeten worden
ingebouwd tijdens de biosynthese van het enzym. Daarnaast is de activiteit
van het enzym gevoelig te meten.
Eigenschappen van β-glucuronidase en de activiteitsmeting
Het enzym β-glucuronidase katalyseert de hydrolyse van glucuronides. Dit
zijn ethers van D-glucuronzuur en een alcohol. In dit experiment zal de ether
van 4 Methyl-Umbelliferon (= 7 hydroxy 4 methyl-coumarine) en D-Glucuronzuur
(MUG) als substraat voor β-glucuronidase worden gebruikt. Het
hydrolyseproduct, 4 Methyl-UmBelliferon (MUB), is alleen maar fluorescent
als de 7 hydroxy groep geïoniseerd is.
- 12 -
Figuur 1.2
De reactievergelijking van de
hydrolyse van MUG en de bijbehorende
structuurformules.

De reactievergelijking is: MUG + H 2 O MUB + Glucuronzuur
De ether (MUG) is dus niet fluorescent en de alcohol, MUB, alleen bij hogere
pH. De pKa van de 7 hydroxygroep van 4 methyl umbelliferon ligt rond pH 8,
vandaar dat de fluorescentie van MUB bij pH 8.5 wordt gemeten.
Factoren die de uitkomst van een fluorescentiemeting kunnen beïnvloeden
1) Zoals in het theoriedeel over fluorescentie is vermeld (zie blok 2), is fluorescentie
een gevoelige meetmethode, maar kan de meting beïnvloed
worden door quenching.
2) Omdat een fluorescentie meeting een absolute meting is, moet er altijd
geijkt worden met een standaard. Dit in tegenstelling tot extinctiemetingen.
De verschillen tussen een fluorescentie- en absorptiemeting
worden uitgelegd op het college en een samenvatting is terug te vinden
bij blok 2 (zie pagina 24).
3) Een activiteitsmeting moet ook door anderen elders uitgevoerd kunnen
worden. Dit betekent dat de reactieomstandigheden bekend moeten
zijn en zodanig dat deze niet afhankelijk zijn van de gebruikte enzymhoeveelheden.
Om hier zeker van te zijn moet de activiteitsmeting bij
verschillende hoeveelheden enzympreparaat worden uitgevoerd, waarbij
gecontroleerd wordt of de gemeten activiteit rechtevenredig is met
de hoeveelheid toegevoegd enzym.
4) Daarnaast heeft de te gebruiken (virtuele) fluorimeter, de SpectroPlus,
de eigenschap dat de fotomultiplier bij het warm worden, binnen 1 tot
2 minuten na het aanzetten, gevoeligheid verliest. Zonder enige verandering
in de fluorescentie daalt de uitlezing een weinig. In dit tijdvenster
kan men dus geen waarneming doen.
5) Wanneer de extractiebuffer verschilt van de reactiebuffer moet men er
op verdacht zijn dat tijdens een activiteitsmeting een enzym actiever of
inactiever wordt. Dit kan ook veroorzaakt worden wanneer de eiwitconcentratie
sterk verandert (verdunnen van een enzym, of adsorptie van
enzym aan het oppervlak van het cuvet). Dit soort processen geeft een
niet-lineair verloop van de reactie in de tijd. Het resultaat is dat de enzymactiviteit
onevenredig laag is ten opzichte van meer geconcentreerde
oplossingen. Met andere woorden de activiteitsmeting is afhankelijk van
de eiwitconcentratie.
Door kritisch naar de recordertracés te kijken (is de activiteit lineair in de tijd)
en bij verschillende hoeveelheid enzym metingen uit te voeren, kan men
er voor zorgen dat de metingen niet beïnvloed worden door de hierboven
genoemde artefacten.
Experimentele procedures en randvoorwaarden
Extractie van het enzym
De onderstaande procedure is door de assistent uitgevoerd en u ontvangt
een virtueel ‘kant en klaar’ preparaat. Het preparaat is afkomstig uit 20 mg
plantmateriaal dat met 100 μL extractiebuffer is geëxtraheerd.
- 13 -

De door de assistent gevolgde extractie procedure
Een leeg Eppendorf reactievaatje is gewogen. Een paar blaadjes zijn in het
Eppendorf vaatje gedaan. Het geheel is opnieuw gewogen (ongeveer 20
mg). Per 20 mg materiaal is 100 μL extractiebuffer toegevoegd en de blaadjes
zijn voorzichtig fijn gewreven in de extractiebuffer met een stamper. Dit
is voorzichtig uitgevoerd omdat anders de extractievloeistof direct uit het
vaatje vliegt. De celresten zijn afgedraaid in een Eppendorfcentrifuge (2
minuten centrifugeren) en het supernatant is overgebracht naar een schoon
vaatje. Dit supernatant bevat de oplosbare celbestanddelen en dus ook het
enzym β-glucuronidase.
Het gebruik van de fluorimeter
De fluorescentie zal met een virtuele MSE SpectroPlus fluorimeter worden
gemeten. De excitatiegolflengte is 370 nm. Het exciterende licht wordt
ontdaan van ‘witlicht’ door het primaire filter dat licht met golflengtes tussen
300 en 400 nm doorlaat. Als secundair filter wordt een Scott KV 408 afkapfilter
gebruikt. Deze beide filters zijn in de cuvettenhouder aanwezig die bij het
apparaat aanwezig is. Er zal in de 90° stand met 1 mL glazencuvetten worden
gemeten. Zie figuur 2.4 in blok 2 en de bijbehorende tekst.
Het opzetten van een activiteitsmeting
Hieronder volgen een serie punten waar rekening mee gehouden moet worden
op het opzetten en uitvoeren van enzymactiviteitsmetingen.
Men heeft de beschikking over:
- Een aantal glazencuvetten met een weglengte van 1 cm waarin men
maximaal 1.2 mL vloeistof kan pipetteren.
- Reactiebuffer. In deze buffer kan de activiteit van het enzym gemeten
worden.
- 4 mL van een geconcentreerde substraatoplossing. Deze bevat 2 mM 4
methyl umbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) in reactiebuffer.
- Plantenextract. Dit is bereid zoals hierboven beschreven. 100 μL extract
bevat de oplosbare celinhoud van 20 mg plantmateriaal. Schrijf op welke
preparaat toebedeeld is.
- Fitprogramma. Er is op de internet site van het programma een ‘fitter’
aanwezig. Via de invoer van een dataset van substraatconcentraties met
de bijgehorende enzymactiviteiten worden de data gefit aan de Michaelis-Menten
vergelijking. Deze fit levert een K M en V MAX waarde op. De
fitdata kunnen via het clipboard worden vastgelegd en worden overgebracht
naar het verslag.
Randvoorwaarden
- De K M waarde van β-glucuronidase (GUS) voor MUG is ongeveer 50 µM.
Met behulp van kennis van de Michaelis-Menten kinetiek moet je nu in
staat zijn een substraatconcentratie te kiezen waarbij het enzym een goede
activiteit heeft en waarbij de activiteitsmeting min of meer onafhankelijk
is van kleine variaties in de substraatconcentratie. Dit is belangrijk
omdat (substraat) toevoegingen altijd enige mate van onnauwkeurigheid
hebben. Daarnaast mag men geen extreem hoge substraatconcentraties
toevoegen omdat MUG een kostbaar stofje is. Bovendien kunnen hoge
substraatconcentraties aanleiding geven tot substraatremming. Realiseer
je dat men nauwkeuriger 50 μL van een 10X verdunde oplossing kan
- 14 -

Meten onder v MAX condities
De Michaelis-Menten vergelijking
is: v = s * V MAX / (s + K M )
Als men onder V MAX condities
wil meten dan kiest men een
substraatconcentratie die 10
maal de K M is. Men meet dan
91% van de theoretisch haalbare
enzymactiviteit.
v = 10*K M *V MAX /(10*K M +K M )
= 10/11 * V MAX
= 0.91 * v MAX
Om 95% van de v MAX te meten
moet de substraatconcentratie
worden opgevoerd tot 18.9 maal
de K M . v = 18.9/19.9 * v MAX
Het rekenvoorbeeld geeft aan
dat het praktisch nooit mogelijk
is de v MAX te kunnen meten. Om
een paar procent meer dan de
91 % van de maximaal haalbare
activiteit te meten moet de
substraatconcentratie veel hoger
worden met het gevaar van substraatremming
en ander artifacten
zoals hoge zoutconcentraties.
Vandaar dat men kiest voor 10
* de K M als conditie om onder
v MAX condities te meten.
toevoegen dan 5 μL van een onverdunde oplossing.
- 20 μL plantenextract is een goede hoeveelheid om de substraat afhankelijkheid
van de enzymactiviteit te testen.
- Met behulp genoemde punten moet je in staat zijn een uitvoeringsprotocol
te maken.
GUS METINGEN
Er moeten een drietal experimenten uitgevoerd worden.
1) Eerst moet de fluorimeter worden gekalibreerd.
2) Vervolgens wordt er bij een vaste hoeveelheid enzym een aantal experimenten
uitgevoerd om de V MAX en K M te kunnen bepalen.
3) Als laatste wordt onder V MAX condities de activiteit bij drie verschillende
enzymconcentraties gemeten.
Overleg met je assistent over het uitvoeringsprotocol en begin daarna met
het vullen van virtuele cuvetten.
- Volg de fluorescentie in de tijd op de recorder. De gevoeligheid van de
fotomultiplier neemt direct na het begin van een meting af. Begin wel
meteen met meten maar realiseer je dat na ongeveer 1-2 minuten de gevoeligheid
stabiel is. Let dus goed op dat de activiteitsmeting niet door
dit fenomeen en ander niet-lineaire fenomenen wordt beïnvloed. Voor
een betrouwbare interpretatie van de enzymactiviteit moet de toename
van de fluorescentie enkele minuten gevolgd kunnen worden op de recorder
en moet de recordertrace een voldoende lineair stuk bevatten om
er zeker van te zijn dat de activiteitsmeting stabiel is.
- In het programma kan een raaklijn aan de curve worden getrokken. Noteer
steeds de gebruikte concentratie enzym, substraat en de gemeten
helling.
1) Het kalibreren van de fluorimeter
De gevoeligheid van de fluorimeter moet geijkt worden. Dit kan door een
interne ijking uit te voeren. Aan reactiebuffer wordt MUB (het fluorescente
product) toegevoegd. Bereken de concentratie en registreer de fluorescentie
. Test meerdere concentraties MUB.
Gebruik deze set waarnemingen om de ijkfactor voor de fluorescentiemetingen
te bereken.
2) Het bepalen van de K M , V MAX waarden
a. Test eerst bij een vaste hoeveelheid bladextract de relatie substraat en
enzymactiviteit.
b. Bepaal door een fit van de dataset (substraatconcetratie-enzymactiviteit)
aan een hyperbool de K M en V MAX waarden voor het enzympreparaat.
3. Wanneer de gegevens niet goed genoeg zijn voor een goede betrouwbare
analyse, herhaal dan enige metingen.
3) Het bepalen van de MUG activiteit van het extract onder V MAX condities
a. Nadat duidelijk is welke de V MAX condities zijn worden verschillende
enzymhoeveelheden getest om te onderzoeken of er een lineair verband
- 1 -

is tussen de hoeveelheid toegevoegd enzym en de activiteit die gemeten
wordt.
b. Ga al tijdens het experiment na of de activiteit rechtevenredig is met de
hoeveelheid toegevoegd bladextract.
Samenstelling van de verschillende buffers
Extractiebuffer: 50 mM K fosfaat (pH 7.0), 1 mM EDTA, 0.1 % Triton X 100 (0.2
g / 200 mL), 10 mM DTT (dithiotreitol) (380 mg / 200 mL)
Reactiebuffer: 0.1 M Tris HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.1 % Triton X 100, 1 mM
DTT
MUG: 10 mM 4-MethylUmbelliferyl- β-D-Glucuronzuur (MUG)
Verslag over blok 1
1) Verslag over het immunoprecipitatie experiment
Beantwoord de volgende vragen puntsgewijs.
- Geef aan hoe je je IgG preparaat hebt gekarakteriseerd.
- Geef de berekening van het percentage reagerende IgG moleculen met een
hoge affiniteit.
- Is de kwaliteit voldoende om het preparaat te gebruiken voor een immunoprecipitatie
van een eiwitcomplex?
- Geef aan welk peptide uit de SDS gel m.b.v. MALDI-TOF en MASCOT is geidentificeerd
en tot welk cellulair complex dit behoort.
2) Verslag over het ELISA experiment
- In het verslag moet worden aangegeven welke het percentage werkzame
antilichamen in het IgG preparaat is geweest. Laat ook de grafiek zien waarmee
dit percentage is berekend.
- Presenteer de ijklijn en de titratie waarmee de concentratie insuline in het
moster is gepaald.
- Geef aan hoe je de concentratie insuline in het monster hebt berekend.
3) Verslag over het β-glucuronidase experiment
Het verslag moet de elementen bevatten die in het deel van de website
‘wring a report’ worden aangegeven. In de resulataten paragraaf moeten de
volgende zaken worden vermeld.
- Presenteer de getallen waarmee de K M en V MAX zijn berekend.
- Laat zien dat onder de door bepaalde V MAX condities de activiteit onafhankelijk
is van de gebruikte hoeveelheden bladextract.
- Bereken uit de fluorescentieveranderingen veroorzaakt door de verschillende
hoeveelheden bladextract de β-glucuronidase activiteit per mg
blad. Druk deze activiteit uit in pmol MUB gevormd . min -1 . (mg planten
materiaal ) -1
- 1 -

Figuur 2.1
Quantum-mechanische voorstelling
van lichtabsorptie en fluorescentie.
GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMENTEN VAN BLOK 2
In de twee experimenten van blok 2 staan methoden centraal waarmee cellulaire
processen en enzymen in vivo en in vitro bestudeerd kunnen worden.
In het in vivo fluorescentie experiment zal ingegaan worden op enige eigenschappen
van een fluorescentiemeting en zal het verschil met een absorptiemeting
worden uitgelegd. Daarna zal de overgang van een aëroob naar
een anaëroob metabolisme in intacte gistcellen worden bestudeerd.
In het tweede experiment (computer graphics en het werkingsmechanisme
van lactaat dehydrogenase) zal worden ingegaan op methoden die men
gebruikt om de werking van een enzym, in dit geval lactaat dehydrogenase,
te bestuderen. De activiteit van het enzym met betrekking tot de reductie
van pyruvaat en oxamaat door NADH zal worden bepaald. Voorts zal met
behulp van fluorescentie worden bestudeerd hoe sterk het enzym NADH
bindt. Omdat de structuur van het enzym met en zonder substraten bekend
is, is het mogelijk ‘te zien’ hoe substraten aan het enzym binden. Door de uitkomst
van de verschillende experimenten te combineren is het mogelijk het
werkingsmechanisme van een enzym op moleculair niveau te ontrafelen.
Hierdoor kunnen we ons een voorstelling maken hoe enzymen als biokatalysator
werken, m.a.w. hoe enzymen (eiwitten) leven mogelijk maken!
THEORIEDEEL: ABSORPTIE EN FLUORESCENTIE
Inleiding
Lichtabsorptie en fluorescentie zijn kwantummechanische verschijnselen,
vandaar dat deze fysische begrippen hier in
eenvoudige termen besproken zullen worden.
Wanneer een molecuul licht absorbeert, is de
energie van het lichtquant gelijk is aan het verschil
tussen twee energieniveaus van het molecuul.
Licht in het UV- en zichtbare gebied is
in staat electronen van organische moleculen
met geconjugeerde bindingen of metalen met
electronen in de d-orbitalen vanuit de elektronische
grondtoestand naar een aangeslagen
toestand te doen overgaan. De elektronische
energieniveaus zijn verbreed door gesuperponeerde
vibratie- en rotatie energieniveaus
(figuur 2.1).
Het primaire absorptieproces waarbij een
elektron vanuit de elektronische grondtoestand naar een aangeslagen baan
overgaat, vindt plaats in ongeveer 10 -15 s. Daarna valt het elektron binnen
10 -13 s terug naar het laagste energieniveau van de eerste aangeslagen
toestand. Er zijn verschillende manieren om terug te komen in de grondtoestand.
Essentieel hierbij is dat de opgenomen energie wordt afgegeven. Dit
kan door:
- de overdracht van een gedeelte van de energie op een ander molecuul
via een botsing (warmteafgifte aan de omgeving)
- 17 -

- energie afgifte door het uitzenden van licht.
- een reactie van het geactiveerde molecuul met een ander molecuul.
- het gebruiken van de energie voor de dissociatie van een binding in het
molecuul.
Als het molecuul terugvalt naar de grondtoestand onder het uitzenden
van licht noemt men dit proces fluorescentie (E = hν). De golflengte van
het uitgezonden fluorescentie licht is altijd groter dan die van het geabsorbeerde
licht. Dit komt omdat het geëxciteerde elektron (zie figuur 2.1) door
het stralingsloos terugvallen naar het laagste energieniveau van de eerste
aangeslagen toestand, energie verliest. Door het verschil in golflengte van
het excitatielicht en de fluorescentie kan men eenvoudig met een filter de
fluorescentie scheiden van het exciterende licht. Dit kan met een afkapfilter.
Dit is een filter dat licht met een kleinere golflengte (het excitatielicht) dan
de afkapgolflengte absorbeert en licht met een grotere golflengte (het fluorescentielicht)
doorlaat.
SPECTROFOTOMETRIE
Opbouw spectrofotometer
Een extinctiemeting (=kleurmeting) wordt met een spectrofotometer
uitgevoerd. De componenten waaruit zo’n apparaat is opgebouwd worden
schematisch in figuur 2.2 weergegeven.
Vanuit een lamp wordt het lamplicht een monochromator ingestuurd. In
de monochromator wordt van het lamplicht via een rooster of prisma een
spectrum gemaakt dat op de uitgangsspleet van de monochromator wordt
geprojecteerd. Omdat een rooster of prisma nooit 100% perfect is, zal het
monochromatisch licht altijd een klein tot zeer klein percentage lamplicht
bevatten. Door aan de golflengteknop te draaien schuift het spectrum langs
deze relatief smalle spleet waardoor er licht met een klein golflengtegebied
door de uitgangsspleet van de monochromator op het in de lichtweg
staand cuvet valt (sample cell). De oplossing in het cuvet absorbeert licht.
- 18 -
Figuur 2.2
Schematische voorstelling van
de opbouw van een spectrofotometer.

Het restant licht valt op de fotomultiplier die een stroompje afgeeft dat
via een versterker op de recorder of de display zichtbaar gemaakt wordt.
De versterkingsfactor van de fotomultiplier kan worden ingesteld door de
hoogspanning op de fotomultiplier te variëren. Dit gaat via de Extra High
Tension, ‘EHT’-knop. Een hogere waarde geeft meer versterking van het fotomultipliersignaal.
Met de ‘zero’-knop is het mogelijk een tegenspanning aan
te leggen waarmee het signaal dat naar de display en recorder gaat als het
ware te verschuiven, zonder dat de gevoeligheid van de meting verandert.
De ‘gain’-knop werkt niet als de functieknop op ‘absorbance’ staat.
Theorie van extinctiemetingen
Voor de meesten van jullie is de wet van Lambert-Beer reeds behandeld. Kort
samengevat zegt de wet van Lambert dat de afname (-dI) van de intensiteit
(I) van een lichtbundel door de absorptie van licht over een zeer klein stukje
van de lichtweg (dl) rechtevenredig is met de intensiteit (I) van de lichtbundel
ter plaatse. In formule -dI/dl = k*I. Daarnaast ontdekte Beer dat een
zelfde relatie opgaat voor de relatie tussen de lichtabsorptie en de concentratie
van de absorberende stof. Op elke positie in de lichtweg is de lichtabsorptie
rechtevenredig met de concentratie van de absorberende stof. In
formule -dI/dl = c*I. Gecombineerd geldt dus -dI/dl = c*k*I. Wanneer deze
differentiaalvergelijking geïntegreerd wordt van het begin van het cuvet (I =
I 0 en l = 0) tot het eind van het cuvet (l = l) wordt de volgende formule voor
de intensiteit van de lichtbundel (I) na het doorlopen van een lichtweg van 1
cm verkregen:
ln(I 0 /I) = k*c*l; I = I 0 e -k*c*l (1)
of op basis van de 10 log (lnx = logx/loge): log(I 0 /I) = log(e)*k*c*l;
I = I 0 *10 -0.4343*k*c*l (2)
I 0 = de intensiteit van de lichtbundel die binnentreedt aan het begin van het
cuvet.
I = de intensiteit van de lichtbundel nadat het licht een afstand l heeft afgelegd
in het cuvet waarbij er licht is geabsorbeerd.
0.4343*k is een molecuul afhankelijke constante en wordt de extinctie coëfficiënt
ε genoemd. De eenheid is M -1 .cm -1 .
c = de concentratie van de absorberende moleculen.
l = de weglengte van het licht door het cuvet, meestal 1 cm.
De factor ‘ε*c’ wordt de extinctie (E) of absorptie (A) van de oplossing genoemd.
De formule, I = I 0 *10 -ε*c*l , geeft de lichtintensiteit aan nadat de lichtbundel
een cuvet heeft doorlopen. Bovendien geeft de formule aan dat de lichtintensiteit
ten gevolge van lichtabsorptie exponentieel afneemt met de doorlopen
weglengte. Tevens geeft de formule aan dat log(I 0 /I) rechtevenredig is
met de concentratie van de absorberende moleculen (log(I 0 /I) = ε*c*l).
De uitvoering van een extinctiemeting
Als er een extinctiemeting wordt uitgevoerd, plaatst men eerst een cuvet
zonder het monster in de lichtweg en meet de hoeveelheid licht die op de
fotomultiplier valt (de blancometing). Deze hoeveelheid licht geeft een
- 19 -

signaal (Iblanco) van de fotomultiplier. Daarna plaatst men het cuvet met
het monster in de lichtweg en meet hoeveel licht er nu op de fotomultiplier
valt: I meting . Tussen de twee metingen in is de I 0 niet veranderd. De I 0 is de
lichtintensiteit die via de lamp en monochromator het cuvet intreedt. De
relatie tussen het concentratieverschil van de absorberende stof in de twee
cuvetten en het signaal van de fotomultiplier van de twee metingen is:
- voor de blanco geldt dat logI 0 /I blanco = ε*c bl *l
- voor het monster geldt dat logI 0 /I meting = ε*c m *l
- het verschil is (met l = 1 cm) ΔE = logI 0 / I meting - logI 0 / I blanco
= ε* (c m -c bl ). ΔE = logI blanco - logI meting = ε * Δc
Bij een moderne spectrofotometer bestaat de mogelijkheid om de blanco op
“0” te zetten. Vaak heeft het apparaat een knop met “set ref”. Wat gebeurt er
dan? Met behulp van electronica wordt het signaal dat van de fotomuliplier
afkomt en verwerkt wordt door een logaritmische versterker op 1 gezet.
Dit signaal is dan het signaal van de blanco. Omdat log 1 nul is verschijnt er
0.000 op de display. Als nu het cuvet met het monster wordt gemeten zal er
lichtabsorptie optreden en wordt het signaal kleiner dan 1 omdat er in dit
geval minder licht op de fotomultiplier valt. De logaritme van een getal kleiner
dan 1 is een negatief getal. De electronica zorgt ervoor dat nu de negatieve
logaritme van het signaal (I) van de fotomultiplier wordt weergegeven
(-logI). Dit wordt dan een positief getal en is direct het lichtabsoptieverschil
tussen de blanco en het monster. Omdat de blanco op “0” was gezet geeft
het getal op de display de extinctie aan en via de extinctie coëfficient is de
concentratie van de absorberende stof eenvoudig uit te rekenen.
E = ε * c.
Het is belangrijk om je te realiseren dan wanneer men praat over de extinctie
van een oplossing, men het verschil in lichtabsorptie tussen de oplossing en
een blanco heeft gemeten. Deze blanco bevat alle ingrediënten die ook in
de oplossing aanwezig zijn behalve de stof waarvan men de lichtabsorptie
wil meten.
De termen extinctie en absorptie worden in de Biochemie door elkaar gebruikt.
In de fysische chemie is de absorptie van een oplossing het deel van
het invallende licht dat geabsorbeerd wordt. In formule is de absorptie dan
(I 0 -I)/I 0 , waarbij I 0 -I de hoeveelheid licht is die geabsorbeerd is.
Strooilicht als foutenbron
Al het licht dat op de fotomultiplier valt en dat niet de golflengte heeft waarop
de monochromator is ingesteld, of dat niet door het meetcuvet is gegaan
en toch de fotomultiplier bereikt, noemt men strooilicht. Naast een niet
goed afsluitend cuvettencompartiment, veroorzaakt de monochromator het
meeste strooilicht. Dit is lamplicht dat op een of andere manier niet gesplitst
in golflengten op de uitgangsspleet van de monochromator terechtkomt.
Als er sprake is van strooilicht dan is het licht dat op de fotomultiplier valt,
opgebouwd uit twee componenten: I m en I s
- I m (het monochromatische licht) en I s (het strooilicht)
- I m wordt wel door concentratie veranderingen van de absorberende
- 20 -
Samenvatting lichtabsorptie
Wanneer moleculen licht absorberen
neemt de lichtintensiteit
van de lichtbundel exponentieel
afneemt in de oplossing.
Hierdoor is de relatie logaritme
van de lichtintensiteit - absorptie
lineair. Hiervan wordt door de
fabrikanten van spectrofotometers
gebruik gemaakt.
Een spectrofotometer geeft op
de display een logaritme van de
lichtintensiteit weer. Vandaar dat
de relatie ΔE (verschil in extinctie
tussen monster en blanco) en Δc
lineair is. De constante die beide
grootheden gelijk maakt is de
molaire extinctie coëfficiënt ε
ΔE = ε Δc

Figuur 2.3
Een schematische voorstelling
van de opbouw van een
fluorimeter
stof in het cuvet beïnvloed en Is niet of nauwelijks.
- Dit heeft tot gevolg dat ingeval van de aanwezigheid van strooilicht
ΔE = log[(I m blanco +I s )/(I m +I s )].
- Als er geen strooilicht is dan is ΔE = log[(I m blanco )/(I m )].
- Als het monster veel licht absorbeert, is I m klein ten opzichte van
I blanco . In dit geval vergroot Is de noemer van de breuk (I m blanco +I s )/
(I m +I s ) meer dan de teller.
- Omdat I m altijd kleiner is dan I blanco betekent dit dat strooilicht de
waargenomen extinctie altijd zal verlagen.
Uit het bovenstaande is duidelijk dat de verhouding strooilicht/monochromatisch
licht de nauwkeurigheid van een extinctiemeting beïnvloedt.
Deze verhouding wordt ongunstig als intensiteit van het lamplicht bij een
bepaalde golflengte laag wordt. Dit is het geval bij een wolfraamlamp bij
golflengten beneden 350 nm. Om het strooilicht weg te vangen kan men bij
golflengten < 350 nm een filter tussen het cuvet en de fotomultiplier plaatsen.
Dit filter absorbeert het licht met een golflengte > 350 nm. Dit is het
niet-monochromatische strooilicht.
FLUORIMETRIE
De opbouw van een fluorimeter en het meten van fluorescentie
Fluorescentie wordt met de SpectroPlus in de fluorescentie-instelling gemeten.
De basiscomponenten zijn in figuur 2.3 weergegeven. Qua opbouw verschilt
een fluorimeter
weinig met een spectrofotometer,
maar er
zijn twee belangrijke
verschillen. Omdat
de intensiteit van de
fluorescentie vaak
vele malen zwakker
is dan de intensiteit
van de exciterende
lichtbundel moet
gezorgd worden dat
er nauwelijks of geen
exciterend licht op de
fotomultiplier valt. Dit
zou een hoog achtergrondsignaal
geven hetgeen de nauwkeurigheid van de fluorescentiemeting
nadelig beïnvloedt.
Bij een fluorescentiemeting met de ‘SpectroPlus’ laat men de lichtbundel die
uit de monochromator komt eerst via een spiegeltje in het cuvettenhuis een
hoek van 90º maken voordat de lichtbundel op het cuvet valt (zie figuur 2.4).
In het cuvet wordt licht door de aanwezige moleculen geabsorbeerd. Dit
verschilt niet van een normale extinctiemeting. De intensiteit van de lichtbundel
neemt dus exponentieel af met de afgelegde afstand in het cuvet.
Omdat de lichtbundel uit de monochromator 90º is afgebogen bereikt
deze de fotomultiplier niet. Wel is het mogelijk dat door verstrooiing door
stofdeeltjes in het cuvet een gedeelte van de exciterende lichtbundel van
- 21 -

ichting wordt veranderd. Dit licht wordt dan door een afkapfilter dat tussen
het cuvet en de fotomultiplier is geplaatst tegengehouden. De moleculen
die licht hebben geabsorbeerd en in een aangeslagen toestand zijn geraakt,
gaan binnen 10 8 s terug naar de grondtoestand waarbij een gedeelte
van de moleculen licht zal uitzenden (fluorescentie). Dit licht wordt in alle
richtingen uitgezonden. Het afkapfilter tussen het cuvet en de fotomultiplier
is zo gekozen dat het excitatielicht geabsorbeerd en het fluorescentielicht
doorgelaten wordt. Het doorgelaten licht wordt vervolgens door de fotomultiplier
geregistreerd.
Om de lichtbundel via een spiegeltje in het cuvettenhuis van de SpectroPlus
90º om te buigen moet de cuvettenstang volledig worden ingedrukt. Zie
figuur 2.4.
Wanneer de oplossing helder is en als het fluorescentielicht niet te sterk
geabsorbeerd wordt door moleculen in de oplossing, kan het cuvet in de
positie naast het spiegeltje in de cuvettenhouder geplaatst worden. De lichtbundel
wordt via de gladde kant door een één mL cuvet geleid. De fluorescentie
wordt onder 90º met de exciterende lichtbundel waargenomen. Dit is
de 90º fluorescentie instelling (Figuur 2.4, afbeelding 2). De fluorescentie kan
via de doffe kant worden waargenomen. De doffe kant verstrooit het reeds
verstrooide fluorescentielicht nauwelijks meer (met een cuvet met rondom
gladde kanten wordt slechts een 10% hoger signaal gemeten).
Ook is het mogelijk het cuvet een positie verder te zetten. Let dan goed
op dat het afstandsblokje de exciterende lichtbundel en fluorescentie niet
onderbreekt. De fluorescentie wordt onder een hoek van 60º waargenomen
waarbij de fluorescentie van een klein gedeelte van het cuvet afkomstig
is. Omdat dit het oppervlak van het cuvet is wordt deze manier van fluorescentie
meten een front-face fluorescentiemeting genoemd (Figuur 2.4,
afbeelding 3). Als men op deze manier de fluorescentie meet is deze minder
gevoelig voor quenching, omdat het traject in het cuvet waarover gemeten
wordt veel minder is. Wel is de gevoeligheid geringer omdat er minder fluorescentielicht
vanuit het cuvet op de fotomultiplier kan vallen.
FACTOREN DIE DE INTENSITEIT VAN DE FLUORESCENTIE BEÏNVLOEDEN
A) De intensiteit van de exciterende lichtbundel
Zoals hierboven is weergegeven, is de lichtabsorptie rechtevenredig met de
concentratie van de absorberende moleculen en wordt er altijd een percen-
- 22 -
Figuur 2.4
De plaats van het cuvet bij
een aborptiemeting, een 90º
fluorescentiemeting en een 60º
‘front face’ fluorescentiemeting

tage van de intensiteit van de lichtbundel ter plaatse geabsorbeerd. Omdat de fluorescentie
rechtevenredig is met het aantal moleculen dat aangeslagen wordt, zal
een twee keer intensere lichtbundel twee keer zoveel moleculen aanslaan en dus
een twee keer grotere fluorescentie ten gevolg hebben. Dus door de intensiteit
van de lichtbundel op te voeren wordt de fluorescentie rechtevenredig verhoogd.
Het verschil in lichtintensitiet verschilt van apparaat tot apparaat en is een belangrijke
reden waarom de fluorescentie apparaat afhankelijk is. Ook de gevoeligheid
van de fotomultiplier voor licht is een oorzaak voor een verschil in gevoeligheid
tussen apparaten.
B) De concentratie van de absorberende stof (zelf-quenching)
Gezien het bovenstaande (meer absorptie, meer fluorescentie) zou men kunnen
denken dat een hogere concentratie van de absorberende stof rechtevenredig
meer fluorescentie zou geven. Het is niet het geval. Hierbij dient men zich te realiseren
dat extinctie- en fluorescentiemetingen essentieel verschillen. Bij een extinctiemeting
meet men de intensiteit van de lichtbundel nadat deze het gehele
cuvet doorlopen heeft. Door lichtabsorptie is de intensiteit van de lichtbundel in
het cuvet exponentieel met de afgelegde weg afgenomen. In de fluorescentieinstelling
doorloopt de lichtbundel uit de monochromator ook het cuvet maar nu
onder een hoek van 90º ten opzichte van de fotomultiplier. Ook nu weer neemt de
intensiteit van de lichtbundel exponentieel af met de doorlopen weglengte. Vanuit
elk punt in de lichtweg wordt t.g.v. de lichtabsorptie fluorescentie uitgezonden
die via het afkapfilter door de fotomultiplier wordt geregistreerd. De waargenomen
fluorescentie is dus een directe afspiegeling van de absolute hoeveelheid
licht die in het cuvet geabsorbeerd wordt. De relatie tussen de concentratie van
de absorberende stof en de hoeveelheid geabsorbeerd licht is niet lineair. Dit is
als volgt in te zien:
De absorptie is op elke plek in het cuvet rechtevenredig (k) met de I (de intensiteit
van de lichtbundel) ter plaatse en de concentratie van de absorberende moleculen.
Een deel (fractie) van het geabsorbeerde licht wordt weer uitgezonden. De
intensiteit van de fluorescentie is dus: fractie*k*c*I. De I neemt door de absorptie
(A = ε*c = ln(10)*ε*c=k*c) af volgens formule (1): I = I 0 *e -k*c*x (1)
(I 0 = de intensiteit van de lichtbundel die op het cuvet valt; x = de afgelegde lichtweg)
De fluorescentie op positie x is, f(x) = fractie*k*c*I(x) = fractie*k*c* I 0 *e -k*c*x
De formule f(x) is te integreren en wordt dan
F(x) = fractie*k*c*I 0 *1/(-k*c)*e -k*c*x en geeft als integraal tussen x = 1 en x = 0
cm: F(1)-F(0) = fractie*I 0 (1- e-k*c).
De fluorescentie die bij een bepaalde concentratie c uit een cuvet komt is dus:
F(1)-F(0) = fluorescentie uit een cuvet = fractie*I 0 (1- e -k*c ).
Deze formule geeft dus de relatie tussen de waargenomen fluorescentie en de
concentratie van de absorberende en fluorescerende stof. Uit de formule blijkt dat
de toename van de fluorescentie bij een oplopende concentratie van de fluorescente
stof exponentieel afvlakt. Het deel van de formule tussen de ‘haakjes’ nadert
dan naar 1 omdat de e-macht naar nul gaat. De relatieve afname van de fluorescentie
bij hogere concentraties noemt men zelf-quenching. Quenching in zijn
algemeenheid is het verschijnsel dat men minder fluorescentie waarneemt dan
dat men op grond van de feitelijke concentratie van de fluorescerende moleculen
zou verwachten. Naast zelf-quenching worden hieronder nog een aantal factoren
- 23 -

ehandeld die de hoeveelheid fluorescentie beïnvloeden.
C) Kwantumefficiëntie
In principe zouden alle moleculen die licht absorberen fluorescent kunnen zijn,
maar deze eigenschap is sterk molecuul afhankelijk. De verhouding tussen de
geabsorbeerde lichtquanta en de uitgezonden lichtquanta noemt men de kwantumefficiëntie.
Er zijn moleculen, zoals fluoresceïne die 60-90 % van het geabsorbeerde
licht weer uitzenden. Andere moleculen, zoals NADH, hebben slechts
een kwantumefficiëntie van 2 %.
Naast de structuur van het molecuul spelen ook de omgevingsfactoren een
belangrijke rol in de kwantumefficiëntie. Factoren zoals polariteit, viscositeit en
temperatuur bepalen de kwantumefficiëntie. Vooral de polariteit en viscositeit
zijn belangrijke factoren omdat deze informatie geven over de micro-omgeving
van fluorescente groepen in eiwitten. Dit kan een fluorescente groep zijn die
aan het eiwit gebonden is, zoals NADH. De meeste eiwitten hebben intrinsieke
fluorescente groepen. Deze zijn de aromatische aminozuurresiduen tryptofaan
en tyrosine. Confirmatieveranderingen in eiwitten veroorzaken soms een verandering
van de polariteit van de fluorescente groep hetgeen zich manifesteert
via een veranderende fluorescentie. Ook de binding van een fluorescente groep
aan een eiwit kan een verandering van de polariteit van de micro-omgeving ten
gevolg hebben die zich als een fluorescentie verandering laat registreren.
D) Verandering van de verhouding stralend/stralingsloos verval (quenching)
Sommige ionen (b.v. Br - of I - ) nemen bij een botsing met een aangeslagen molecuul
de energie van het terugvallende elektron op zodat er geen licht wordt
uitgezonden.
E) Absorptie van het uitgezonden licht
Het uitgezonden licht kan door de fluorescerende moleculen zelf worden geabsorbeerd,
maar omdat het excitatie- en het emissiespectrum nauwelijks overlappen
(zie figuur 2.1), is deze bijdrage meestal gering. Wel is absorptie door andere
moleculen, waarvan het absorptiespectrum een significante overlap met het
emissiespectrum vertoont, een niet te verwaarlozen bijdrage.
SAMENVATTING VAN DE VERSCHILLEN TUSSEN EEN EXTINCTIE- EN
EEN FLUORESCENTIEMETING
In de fluorescentie instelling wordt het fotomultipliersignaal lineair versterkt.
Bij een goed geconstrueerd apparaat zal er uitsluitend fluorescentielicht op de
fotomultiplier vallen. Hierdoor kan men de versterking opvoeren en dit geeft de
mogelijkheid om zeer kleine lichthoeveelheden te kunnen waarnemen. Fluorescentie
is om deze reden veel gevoeliger te meten dan lichtabsorptie. In het geval
van lichtabsorptie meet je de afname van je 100% signaal. Een kleine afname
van 100% is veel minder goed electronisch te versterken dan een kleine toename
met geen signaal als uitgangspunt. Een nadeel van fluorescentie is dat de
grootte van het signaal apparaat afhankelijk is. Bij het ene apparaat is de lichtintensiteit
die op het cuvet valt anders dan bij het andere apparaat en de gevoeligheid
van de fotomultiplier verschilt van apparaat tot apparaat. Dit heeft tot
gevolg dat men het signaal altijd moet ijken. Dit is bij een extinctiemeting niet
nodig omdat een extinctiemeting altijd ten opzichte van een blanco plaatsvindt.
Hierdoor wordt de uitkomst van de meting onafhankelijk van de intensiteit van
de lichtbundel.
- 24 -

Figuur 2.5
Links staat het absorptiespectrum
van NADH, rechts het fluorescentie
emissie spetrum. Merk op dat de
schaalverdeling op beide y-assen
verschilt en dat fluorescentie optreedt
bij hogere golflengten dan
lichtabsorptie.
(in vivo) FLUORESCENTIE
Doel van het experiment
In dit experiment wordt het verschil in gevoeligheid en de concentratieafhankelijkheid
van een extinctie- en een fluorescentiemeting bestudeerd en
vergeleken. Dit wordt gedaan door:
1) de extinctie van verschillende NADH oplossingen te meten.
2) de fluorescentie van dezelfde NADH oplossingen te meten
3) Vervolgens wordt de kracht van fluorescentie aangetoond door de NADH
concentratie in intacte gistcellen met behulp van fluorescentie te volgen
bij de overgang van een aëroob naar een anaëroob energiemetabolisme.
4) Het proces zal ook nog gevolgd worden via het meten van de zuurstofconcentratie
van de gistoplossing met behulp van een zuurstofelectrode.
In figuur 2.5 is het absorptiespectrum van NADH weergegeven
en het uit de absorptie voorkomende spectrum van
het fluorescentielicht. NADH absorbeert voldoende licht
tussen de 300 en 360 nm en de fluorescentie kan met een
fliter dat licht met een golflengte boven de 408 nm worden
gedetecteerd. Licht laten absorberen bij 360 nm (dan is de
intensiteit van de lichtbron veel hoger dan bij 340 nm) en de
fluorescentie meten boven de 408 nm kan dus prima met
een SpectroPlus.
Bediening van een SpectroPlus
Voordat je begint met de metingen is het noodzakelijk dat
je je realiseert hoe het apparaat, de SpectroPlus, in elkaar zit
waarmee je de metingen zult gaan uitvoeren. De assistent
heeft je in de inleiding over dit blok het onderstaande laten zien.
1) Het cuvettenhuis kan op drie posities geplaatst worden ten opzichte van
de fotomultiplier. Geef je rekenschap in welke posities je een extinctiemeting
moet uitvoeren en in welke positie een fluorescentiemeting mogelijk
is (Zie figuur 2.4). Overtuig je waar je het cuvet in de houder moet neerzetten
om een 90° fluorescentie en een 60° (front face) meting te kunnen
uitvoeren.
2) Voordat bij een fluorescentiemeting het deksel van het cuvettenhuis
wordt gehaald moet de functieknop op “O 2 ” worden gezet en het strooilichtfilter
in de lichtweg worden geduwd. Dit is nodig omdat anders de
fotomultiplier door teveel licht ‘opgeblazen’ wordt.
1) EXTINCTIEMETINGEN
SpectroPlus als spectrofotometer: een extinctiemeting van NADH
• Zet de monochromator op 340 nm.
• Er is door de assistent een NADH oplossing gemaakt. Deze oplossing is
ongeveer 1 mM. Gebruik deze oplossing om oplossingen van 0.02, 0.1 en
0.2 mM NADH in 10 mM Tris/HCl pH 8.0 te maken. Eén mL van elke oplossing
is voldoende. Bewaar de oplossingen voor een fluorescentiemeting!
Realiseer je dat de blanco, het punt 0,0 in een grafiek, ook een meetpunt
is.
• Meet de extinctie van de 0.02, 0.1 en 0.2 mM NADH oplossingen bij 340
- 25 -

nm in een één mL cuvet t.o.v. een cuvet met Tris/HCl buffer met het
strooilichtfilter in de lichtweg. Schrijf de waarden op want deze heeft je
voor het schrijven van het verslag nodig. Uit deze waarden moet je met
behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt van NADH bij 340 nm (ε =
6300 M -1 .cm -1 ) de exacte concentratie van de verstrekte NADH oplossing
uitrekenen.
2) FLUORESCENTIEMETINGEN
De SpectroPlus als fluorimeter: het detecteren van NADH fluorescentie
Met de onderstaande procedure kan men een fluorescentiemeting van
NADH uitvoeren. Het apparaat is zo geconstrueerd dat wanneer er meer licht
op de fotomultilplier valt de uitlezing een negatiever getal zal aangeven. Dus
hoe negatiever het getal op de display hoe meer fluorecentie wordt geproduceerd
en waargenomen.
• Voor het meten van de NADH fluorescentie zet men de monochromator
op 360 nm.
• De metingen worden met de EHT knop op 4 in de 90° fluorescentie instelling
uitgevoerd (zie figuur 2.4 van theoriedeel over absorptie en fluorescentie).
De gain-knop is door de assistent op zijn maximale waarde gezet.
• Voordat bij een fluorescentiemeting het deksel van het cuvettenhuis
wordt gehaald moet de functieknop op “O 2 ” worden gezet en het strooilichtfilter
in de lichtweg worden geduwd.
• De excitatiegolflengte is 360 nm en de lichtbundel valt via het UV-filter
(laat alleen licht tussen 300 en 400 nm door) op het spiegeltje in de cuvettenhouder
en vervolgens op het cuvet. Het geëmitteerde licht wordt
via een 408 nm afkapfilter gemeten. Let op dat de cuvettenhouder goed
in de pinnetjes wordt gezet.
• Nadat het deksel op het cuvettenhuis is geplaatst, mag de functieknop
op “fluor” worden gezet en wordt het strooilichtfilter uit de lichtweg gehaald.
Er wordt eventueel een zwartelap over het cuvettendeksel gelegd
voor een optimale afdichting.
• Bij het verwisselen van cuvetten wordt dezelfde procedure in omgekeerd
volgorde uitgevoerd. Eerst wordt het strooilichtfilter in de lichtweg geplaatst,
vervolgens wordt de functieknop op O 2 gezet. Daarna wordt het
deksel van het cuvettenhuis weggehaald.
Het meten van de relatie tussen de NADH concentratie en NADH fluorescentie:
het fenomeen (zelf)quenching
• Maak nog een aantal verdunningen van de NADH oplossing met het
opschrift 1 mM. De volgende verduningen in buffer (10 mM Tris/HCl, pH
8.0) moeten worden gemaakt zodanig dat er 1 mL van 5, 10, 40 en 80 μM
NADH beschikbaar is om gemeten te worden. De oplossingen van 20, 100
en 200 μM heb je al gemaakt en gebruikt voor extinctiemetingen. Een
oplossing met alleen Tris-buffer wordt als blanco (aftelpunt = datapunt 0,
0) gebruikt.
• De metingen worden met de EHT knop op 4 in de 90º fluorescentie instelling
(zie figuur 2.4) uitgevoerd.
• De uitlezing van een cuvet met alleen buffer (blanco) wordt met de ‘zero’knop
op ‘0.0’ gezet. In tegenstelling tot extinctiemetingen geeft meer
fluorescentie een grotere negatieve uitlezing. In de fluorescentiestand
- 26 -

wordt het signaal dat afkomstig is van de fotomultiplier negatief weergegeven.
Meer licht op de fotomultiplier en dus een lagere uitlezing.
• Na het meten van de fluorescentie van een cuvet met alleen buffer
(blanco), wordt nu de fluorescentie van alle bereide NADH oplossingen (5
tot en met 200 μM) in 1 mL glascuvetten gemeten.
• Controleer af en toe of de blanco nog steeds een uitlezing van nul geeft.
Zo nee, stel deze bij met de zeroknop.
• In het verslag moet je de waargenomen fluorescentie uitzetten tegen de
NADH concentratie. Ook moet je nu je getallen met die van je collega’s
vergelijken. In het verslag moet je aangeven wat je opvalt en hoe dit te
verklaren is.
3) IN VIVO FLUORESCENTIE VAN NADH IN GISTCELLEN
• Voordat je de oplossingen in een cuvet gaat pipetteren, moet je doornemen
welke handelingen er uitgevoerd moeten worden en wordt de
recorder aangezet. Dit is nodig omdat onmiddellijk na het toevoegen van
de gistcellen aan het cuvet de reactie gaat verlopen en dus de registratie
van de fluorescentie zo snel mogelijk moet plaatsvinden. Noteer op de
recorder het tijdstip waarop de gistcellen aan het cuvet worden toegevoegd.
Realiseer je dat de reactie start ook al wordt de fluorescentie niet
geregistreerd!
• 2.44 mL (aërobe) KP i buffer (0.1 M, pH 7.0) en 0.06 mL glucose (1 M) wordt
in een 3 mL quartzcuvet gepipetteerd. Het cuvet wordt in de cuvettenhouder
geplaatst in de frontface instelling (zie figuur 2.4; afbeelding C
van Theorie van lichtabsorptie en fluorescentie). Het exitatielicht is 360
nm en er wordt gemeten op EHT stand 5. Wanneer alle instellingenn juist
zijn en de afspraken gemaakt wordt 0.5 mL gistsuspensie (10% w/v, 4 uur
gehongerd om het niveau van de endogene substraten te verlagen) aan
het cuvet dat in de cuvettenhouder staat toegevoegd. Geef dit moment
aan op het recorderpapier. De inhoud van het cuvet wordt gemengd en
wordt in het apparaat geplaatst. Daarna wordt met de zeroknop zo snel
mogelijk de uitlezing op ± -200 ingesteld. De fluorescentie wordt in de
tijd (ongeveer 15 minuten) op de recorder gevolgd.
• Als de uitlezing stabiel geworden is, wordt 5 μL aceetaldehyde (3 M) aan
het cuvet toegevoegd. Na voorzichtig mengen wordt de fluorescentie
gevolgd totdat de oorspronkelijke fluorescentie weer is bereikt..
• Nu wordt 5 µL 2.5% H 2 O 2 toegevoegd en na mengen wordt de fluorescentie
weer gevolgd totdat het niveau van voor de toevoeging weer is
bereikt.
4) ZUURSTOFMETING
In een oxygraaf wordt de zuurstofconcentratie in een oplossing gemeten. De
werking van een oxygraaf wordt bij de urinezuurproef van blok 3 uitgelegd.
Het bovenstaande experiment is de NADH fluorescentie in gistcellen gevolgd.
Nu wordt het experiment in het reactievaatje van een zuurstofmeter
(oxygraaf) uitgevoerd. De zuurstofconcentratie wordt onder precies dezelfde
omstandigheden gevolgd als de fluorescentiemeting.
• 2.44 mL aërobe KP i buffer (0.1 M, pH 7.0) en 0.06 mL glucose (1 M) wordt
in het reactievaatje van een oxygraaf gepipetteerd. Als laatste wordt 0.5
mL gistsuspensie toegevoegd waarna de oxygraaf met de speciale dop
- 27 -

wordt afgesloten en wel zodanig dat er geen luchtbelletjes meer in het
reactievaatje tussen de vloeistof en de dop aanwezig zijn.
• De zuurstofconcentratie wordt in de tijd op de recorder gevolgd.
• Wanneer de zzurstofconcentratie drie minuten onveranderd is gebleven,
wordt 5 µL aceetaldehyde toegevoegd, waarna de meting nog ongeveer
5 minuten wordt gevolgd.
• Voeg daarna 5 µL 2.5% H 2 O 2 en wacht totdat de toegevoegde waterstofperoxide
(via het enzym katalase wordt dit omgezet tot zuurstof) is
verbruikt door de gistcellen.
HET WERKINGSMECHANISME VAN LACTAAT DEHYDROGENASE
Doel van het experiment
De onderstaande proeven worden uitgevoerd met als doel inzicht te verkrijgen
in enzymkatalyse en de bijbehorende thermodynamica.
Hiertoe wordt:
1) de activiteit van het enzym lactaat dehydrogenase met pyruvaat, oxamaat
en lactaat bij verschillende pH’s gemeten en wordt gewacht totdat
de reactie in evenwicht is gekomen.
2) de binding van NADH aan het enzym gevolgd met behulp van fluorescentie.
3) met behulp de fluorescentie waarden de bindingsconstante van NADH
aan lactaat dehydrogenase uitgerekend.
4) Bij de activiteitsmetingen is de reactie gevolgd totdat de NADH concentratie
niet meer veranderd. Dit geeft aan dat de reactie in evenwicht is en
met behulp van de extinctieveranderingen zullen de concentraties van
de reactanten worden uitgerekend. De concentraties van de reactanten
in de evenwichtssituatie worden gebruikt om de standaard vrije energie
van de reactie uit te rekenen.
5) Als laatste wordt de kristalstructuur van het enzym op het computerscherm
bestudeerd.
Door de experimenten te combineren ben je in staat te begrijpen hoe het
enzym de reactie katalyseert. Tevens hopen we dat je dan enig inzicht heeft
verkregen in de manier waarop enzymen werken, namelijk het verlagen van
de activeringsenergie waardoor reacties die zonder katalysator niet plaatsvinden
nu gecontroleerd in de cel kunnen verlopen.
Inleiding
Voor het verkrijgen van inzicht in het werkingsmechanisme van enzymen
is de structuur van het enzym onontbeerlijk. De afgelopen jaren is de structuurbepaling
van enzymen en eiwitten in een stroomversnelling geraakt.
Deze ontwikkeling is mogelijk gemaakt door het beschikbaar komen van
geavanceerde apparatuur voor het opnemen van de Röntgen verstrooiingspatronen
van een eiwitkristal, snelle computers voor het uitrekenen van de
Röntgen verstrooiingspatronen en het zichtbaar maken van driedimensionale
structuren op een computerscherm.
De tweede factor is de ontwikkeling van de recombinant DNA technologie.
Met behulp van deze technologie is het relatief eenvoudig geworden om via
- 28 -

het sequencen van DNA de aminozuurvolgorde van een eiwit te bepalen.
Ook zijn methoden ontwikkeld om eiwitten op grote schaal te produceren
en te modificeren. Door deze ontwikkelingen is het bepalen van de driedimensionale
structuur van een eiwitmolecuul vergeleken met 30 jaar geleden
eenvoudiger en vooral sneller geworden. Naast de kristallografie kan de
multidimensionale NMR ook gebruikt voor de structuurbepaling van kleinere
eiwitten (< 30 kDa).
Voor het op moleculair niveau doorgronden van de enzymkatalyse is kennis
van de structuur van een enzym noodzakelijk. Maar met alleen deze
informatie is het werkingsmechanisme van een enzym niet volledig op te
helderen omdat structuurfluctuaties vaak essentieel zijn voor de katalyse.
Kristallen geven slechts informatie over één structuur tenzij men kristallen
kan groeien van verschillende conformaties van het eiwit, geïnduceerd door
de binding van substraten/remmers.
Algemene eigenschappen van lactaat dehydrogenase (Biochemistry
hoofdstuk 8, 6de editie p. 223; 5de editie p. 207)
Lactaat dehydrogenase (LDH) is een belangrijk enzym in een aantal metabole
routes. Het vormt de spil in het evenwicht tussen het anabolisme en
het katabolisme van koolhydraten. De reactievergelijking van de door LDH
gekatalyseerde reactie is:
pyruvaat + NADH + H + lactaat + NAD +
In de anaërobe glycolysereacties van de skeletspier is LDH het laatste enzym
in een serie, die de omzetting van glucose (glycogeen) in lactaat katalyseren
waarbij er per glucose molecuul twee moleculen ATP gevormd worden. Het
in de spier gevormde lactaat diffundeert naar het bloed waar het na opname
door de lever wordt omgezet in pyruvaat en vervolgens via de reacties van
de gluconeogenese in glucose of glycogeen.
In aërobe weefsels zoals hartspier, wordt lactaat opgenomen uit het bloed
en via LDH omgezet in pyruvaat dat daarna via de citroenzuurcyclus en
ademhalingsketen wordt geoxideerd waarbij er per lactaat ongeveer 14
moleculen ATP worden gevormd.
Mensen hebben twee LDH genen. Een H- en een M-type. De aminozuurvolgorde
is voor 75% identiek. Een werkzaam lactaat dehydrogenase bestaat uit
vier subeenheden die elk een katalytische plaats hebben. Met twee genen
zijn dus vijf combinaties mogelijk die allen worden aangetroffen. De differentiële
expressie van de twee LDH genen is weefselspecifiek. Het H-type enzym
heeft een hoge affiniteit voor de substraten (werkt dus reeds optimaal
bij lage substraatconcentraties) maar wordt bij wat hogere pyruvaatconcentraties
geremd. Deze eigenschappen zorgen ervoor dat in hartspier (met
overwegend H-type enzym, H4) bij een hoge pyruvaatproductie, pyruvaat
niet omgezet wordt in lactaat. In skeletspier waar overwegend het M-type
aanwezig is (M4), wordt bij een hoge pyruvaatproductie, pyruvaat wel omgezet
in lactaat. De hartspier kan hierdoor niet verzuren en ophouden met
werken, de skeletspier kan wel tijdelijk een grote inspanning leveren, maar
verzuurt dan wel.
- 29 -

Zoals bij elke chemische reactie bepalen de concentraties van de reactanten
de richting van de reactie. Voor de door LDH gekatalyseerde reactie bepalen
dus de concentraties van pyruvaat/lactaat en NAD + /NADH en de pH of de
reactie naar links of naar rechts zal verlopen. Daarnaast katalyseren weefselspecifieke
isoenzymen de heen- en teruggaande-reactie met verschillende
snelheden en is de substraatremming (pyruvaatremming) verschillend. Hartcellen
bevatten het isoenzym H4 (vier identieke subeenheden van het type
H, die tezamen een enzymcomplex vormen). Skeletspiercellen en levercellen
bevatten veel isoenzym M4. H4 wordt geremd door hoge pyruvaatconcentraties
zal dus niet de lactaatvorming katalyseren. Het enzym katalyseert bij
voorkeur de oxidatie van lactaat. M4 heeft geen last van de pyruvaatremming
en wordt dus gebruikt in cellen voor de reductie van pyruvaat naar
lactaat.
Het kinetisch gedrag van LDH is karakteristiek voor nagenoeg alle pyridine
nucleotide (NAD(P)(H)) afhankelijke dehydrogenasen. NADH bindt eerst
aan het enzym gevolgd door pyruvaat. Na de hydride (H - ) overdracht vanaf
NADH naar pyruvaat en protonering van de ketogroep, verlaat lactaat als
eerste het enzym, gevolgd door NAD + . Dit type reactie wordt een ordered
sequential mechanisme genoemd. In het onderstaande schema zijn de acht
intermediaire vormen van het enzym weergegeven (zie figuur 2.6).
Het bepalen van de verschillende reacties van een katalytische cyclus
De verschillende reacties en hun snelheidsconstantes zijn bepaald met
klassieke ‘steady-state’ en snelle ‘pre-steady-state’ kinetiek. Bij steady-state
kinetiek meet men de langzaamste stap(pen) van de katalytische cyclus.
Door bijvoorbeeld de substraatconcentratie(s) te variëren van een enzymactiviteitsmeting,
krijgt men informatie over de reacties waarbij de binding
van de substraten aan het enzym van belang zijn. De tijdschaal van deze
experimenten is vanaf een paar seconden tot enige minuten. Bij pre-steadystate
kinetiek kijkt men naar eigenschappen van het enzym tijdens het
‘eerste rondje’ van de katalytische cyclus. Men mengt enzym zeer snel met
het substraat (binnen 2 milliseconden)
en kijkt naar een of meerdere
eigenschappen van het enzym,
het substraat of het enzym-substraatcomplex.
Een eigenschap
die waardevolle informatie kan
geven over de katalytisch cyclus is
de tryptofaan fluorescentie. In alle
eiwitten is de tryptofaan fluorescentie
afhankelijk van zijn microomgeving
en die kan veranderen
met de verschillende conformaties
van het enzym. Door nu de tryptofaan
fluorescentie te volgen in de
tijd, tijdens het eerste rondje van de
cyclus, kan men informatie krijgen
over conformatie veranderingen in
het enzym. Bijvoorbeeld: het vrije
enzym heeft een grote tryptofaan
- 30 -
Figuur 2.6
De verschillende conformaties
van lactaatdehydrogenase in een
volledige reactiecyclus. merk op
dat het een ‘ordered sequential’
mechanisme is.

Tabel 2.1
Effect van plaatsgerichte mutagenese
op de katalytische eigenschappen
van lactaat dehydrogenase.
Arg 106 betekent dat het 106 de
aminozuur vanaf het NH2-terminale
uiteinde van de polypeptideketen
arginine is.
fluorescentie. Deze is lager wanneer NADH is gebonden. Ook kan men de
fluorescentie van een fluorescent substraat volgen. Bijvoorbeeld de NADH
fluorescentie neemt toe wanneer NADH bindt aan LDH. Wanneer nu naast
NADH, pyruvaat bindt neemt de fluorescentie van het gebonden NADH
weer af en deze verdwijnt volledig wanneer NAD + en lactaat zijn gevormd.
Uit dit soort pre-steady-state experimenten bepaalt men de snelheidconstantes
van de verschillende deelreacties van de katalytische cyclus.
Plaatsgerichte mutagenese (Biochemistry 6de editie p. 147 – p. 148; 5de
editie, p. 164 - p. 165)
Daarnaast is het maken en karakteriseren van mutant enzymen een belangrijk
hulpmiddel om het werkingsmechanisme van enzymen te begrijpen.
Met behulp van plaatsgerichte mutagenese (zie is men tegenwoordig in
staat heel specifiek aminozuurresiduen in enzymen te veranderen. Nadat
een aminozuurresidu is veranderd wordt het effect op kinetische eigenschappen
van het enzym bestudeerd. In de tabel 2.1 zijn een aantal aminozuurveranderingen
in LDH en hun kinetisch effecten samengevat.
Samenvattend
Door de kinetiekgegevens met structuurgegevens te combineren, is men
in staat een werkingsmodel voor een enzym op te stellen. Dit is het belangrijkste
leerdoel van dit in silico experiment. Om het structuurgedeelte van
dit experiment zinvol door te werken is het noodzakelijk dat je de volgende
zaken paraat heeft (in uw hoofd of op papier):
• de structuur van de aminozuren,
• het begrip pKa in relatie tot de ladingseigenschappen van de aminozuurresiduen,
• de begrippen ionogene binding, van der Waals interactie, waterstofbindingen
en het hydrofobe effect.
Deze gegevens zijn in Biochemistry 6de editie p. 6 – p. 10, p. 14 – p. 17,
p. 27 – p. 34; 5de editie p. 8 – p. 11, p. 43 – p. 44, p. 50 en p. 73 – p. 74 te
vinden.
Effecten verandering aminozuursamenstelling op eigenschappen van LDH
Arg106 in Gln106: De hydride overdrachtsnelheid is sterk gereduceerd (< 0.07 % van de wildtype activiteit).
De pyruvaat binding is verminderd, maar er is geen effect op de coenzymbinding.
Tevens neemt de NADH fluorescentie niet significant af na het toevoegen van
oxamaat. Dit vindt wel plaats in het wildtype enzym.
Asp166 in Ala166 of Asn166 Vermindering van de bindingsaffiniteit voor pyruvaat maar niet voor lactaat. Tevens
wordt een verlaging van hydride overdrachtsnelheid gevonden.
Arg169 in Lys169 De bindingsaffiniteit voor pyruvaat is slechts 0.05%
Ile249 in Asn249 Verlaging van de bindingsaffiniteit voor NADH en pyruvaat
- 31 -

EXPERIMENTEEL GEDEELTE VAN LACTAAT DEHYDROGENASE
(LDH-1)
Het meten van de lactaat dehydrogenase activiteit
In dit experiment wordt de activiteit van lactaat dehydrogenase gemeten.
Dit wordt uitgevoerd met een Pharmacia spectrofotometer. De activiteit
van het hartspier LDH isoenzym (H4) wordt gemeten door de absorptie van
NADH, een van de substraten in de reactie, bij 340 nm in de tijd te volgen. Er
worden vier experimenten uitgevoerd waarbij de activiteit met pyruvaat ±
oxamaat + NADH en met lactaat + NAD + wordt bepaald. De reactie vergelijking
is:
pyruvaat + NADH + H + lactaat + NAD +
1) LDH activiteitsmeting met pyruvaat bij pH = 7.0
Voeg aan een 1 mL cuvet de volgende oplossingen toe en voer de aangegeven
handelingen uit:
• Voeg 0.97 mL 0.1 M KP i (kaliumfosfaat buffer) pH 7.0 toe
• Voeg 0.01 mL 10 mM pyruvaat toe en meng de oplossing in het cuvet.
• Plaats het cuvet in de spectrofotometer en zet de absorptie op nul via de
‘set ref’ knop.
• Voeg 0.01 mL 10 mM NADH toe en meng.
• Meet de absorptie gedurende ongeveer 1 minuut.
• Voeg 0.01 mL LDH (0.1 mg/mL ) toe, meng en plaats het cuvet zo snel
mogelijk na het mengen terug in de spectrofotometer.
• Meet de absorptiedaling op de recorder totdat de uitlezing stabiel is.
2) LDH activiteitsmeting met oxamaat bij pH = 7.0
Voeg aan een 1 mL cuvet de volgende oplossingen toe en voer de aangegeven
handelingen uit:
• Voeg 0.96 mL 0.1 M KP i pH 7.0 toe
• Voeg 0.01 mL 10 mM oxamaat toe en meng de oplossing in het cuvet.
• Plaats het cuvet in de spectrofotometer en zet de absorptie op nul via de
‘set ref’ knop.
• Voeg 0.01 mL 10 mM NADH toe en meng.
• Meet de absorptie gedurende ongeveer 1 minuut.
• Voeg 0.01 mL LDH (0.1 mg/mL ) toe en meng.
• Registreer de absorptie veranderingen. Wanneer er geen noemenswaardige
reactie optreedt, wordt aan het cuvet 0.01 mL 10 mM pyruvaat
toegevoegd. Na toevoegen van pyruvaat en mengen moet het cuvet zo
snel mogelijk terug geplaatst worden in de spectrofotometer en wordt de
absorptie gedurende ongeveer 3 minuten gevolgd.
3) LDH activiteitsmeting met pyruvaat bij pH = 8.5
Voeg aan een 1 mL cuvet de volgende oplossingen toe en voer de aangegeven
handelingen uit:
• Voeg 0.96 mL 0.1 M Tris-HCl buffer pH = 8.5 toe
• Voeg 0.01 mL 10 mM pyruvaat toe en meng de oplossing in het cuvet.
• Plaats het cuvet in de spectrofotometer en zet de absorptie op nul via de
‘set ref’ knop.
• Voeg 0.01 mL 10 mM NADH toe en meng.
- 32 -
Figuur 2.7
Het absorptie spectrum van
NADH en NAD +

• Meet de absorptie gedurende ongeveer 1 minuut.
• Voeg 0.02 mL LDH (0.1 mg/mL ) toe, meng en plaats het cuvet zo snel
mogelijk na het mengen terug in de spectrofotometer.
• Meet de absorptiedaling op de recorder totdat de uitlezing stabiel is.
4) LDH activiteitsmeting met lactaat bij pH = 8.5
Voeg aan een 1 mL cuvet de volgende oplossingen toe en voer de aangegeven
handelingen uit:
• Voeg 0.97 mL 0.1 M Tris-HCl buffer pH = 8.5 toe
• Voeg 0.01 mL 1 M lactaat toe en meng de oplossing in het cuvet.
• Plaats het cuvet in de spectrofotometer en zet de absorptie op nul via de
‘set ref’ knop.
• Voeg 0.01 mL 10 mM NAD + toe en meng.
• Meet de absorptie gedurende ongeveer 1 minuut.
• Voeg 0.01 mL LDH (0.1 mg/mL ) toe, meng en plaats het cuvet zo snel
mogelijk na het mengen terug in de spectrofotometer.
• Meet de absorptietoename op de recorder totdat de uitlezing stabiel is.
HET BEPALEN VAN DE BINDINGSCONSTANTE VAN NADH AAN LDH
m.b.v. FLUORESCENTIE
De binding van NADH aan het enzym lactaat dehydrogenase kan bestudeerd
worden door de verandering van de NADH fluorescentie te meten.
Het blijkt namelijk dat de NADH fluorescentie toeneemt als NADH aan het
enzym bindt. Deze toename van de NADH fluorescentie wordt ook gevonden
als men NADH in een meer apolair oplosmiddel oplost. Vandaar dat te
verwachten is dat het bindingsoppervlak van NADH in het enzym apolair is.
Tijdens de bindingsexperimenten reageert NADH niet omdat het tweede
substraat van het enzym, pyruvaat, niet wordt toegevoegd. Wel wordt oxamaat
toegevoegd. Dit molecuul is een isosterisch en isoelectronisch analoog
van pyruvaat en bindt analoog aan pyruvaat aan het enzym. Maar omdat
de methylgroep van pyruvaat is vervangen door een aminegroep is NADH
niet in staat oxamaat te reduceren. Dit komt door de electronenstuwende
eigenschappen van de aminegroep. Als het goed is heeft je zojuist gezien
dat oxamaat geen afname van de NADH absorptie gaf, en dus niet wordt
omgezet door LDH.
Uitvoering van het experiment
- De assistent heeft de gevoeligheidsknop (gain) maximaal gezet en de EHT
op 5. De functieknop van de SpectroPlus staat als een experiment begonnen
wordt op ‘O2’ en het strooilichtfilter ‘< 350 nm’ staat in de lichtweg. De
golflengte staat op 359 nm en de cuvettenhouder heeft een ‘UV’ (300-400
nm) filter en een 408 nm afkapfilter. Het cuvet wordt in de 90° fluorescentie
stand gemeten. Zie in vivo fluorescentie en het fluorescentie theoriedeel
figuur 2.4.
- In alle experimenten wordt de NADH concentratie constant gehouden,
namelijk 4 μM.
1) NADH fluorescentie in buffer
- Pipetteer 0.97 mL KP i buffer (0.1 M, pH 7.0) in een 1 mL cuvet. Zet het
cuvet steeds precies recht achter het spiegelblokje in de cuvettenhouder
van een SpectroPlus, de ‘doffe’ kant richting fotomultiplier. Plaats de cuvet-
- 33 -

tenhouder van de SpectroPlus in de fluorescentie stand. Het cuvettenhuis
wordt met de deksel en een zwarte lap afgesloten. Zet nu de functieknop
op ‘Fluorescence’ en vergeet niet het strooilichtfilter uit de lichtweg te
halen.
- De uitlezing wordt met behulp van de “zero”knop op 0.00 gezet. Na ongeveer
30 seconden is de uitlezing stabiel.
- Voordat het deksel van het cuvettenhuis wordt afgehaald, wordt de functieknop
op “O 2 ” gedraaid en het strooilichtfilter in de lichtweg geduwd.
- Voeg nu aan het cuvet 40 μL 0.1 mM NADH toe en meng de inhoud van
het cuvet voorzichtig. Let op dat het cuvet weer precies recht achter het
spiegelblokje staat. Meet de fluorescentie en vul de waarde in tabel 2.2 in.
2) NADH fluorescentie in aceton
- Herhaal dit experiment met 0.96 mL aceton in plaats van KP i buffer. Voeg
na het op ‘nul’ zetten 40 μL 0.1 mM NADH toe en meet de fluorescentie.
Vul het getal in tabel 2.2 in.
3) NADH fluorescentie in aanwezigheid van lactaat dehydrogenase en
het effect van oxamaat (3a)
- Nu wordt de fluorescentie van NADH gemeten waarbij een gedeelte van
het NADH aan LDH gebonden is. Dit wordt bewerkstelligd door 0.03 mL
LDH (2.5 mg/mL ) aan 0.93 mL KP i buffer toe te voegen. De fluorescentieuitlezing
van het cuvet met buffer en LDH wordt op nul gezet.
- Vervolgens wordt 40 μL NADH toegevoegd en wordt de fluorescentie
opnieuw gemeten en wordt de waarde in tabel 2.2 ingevuld. Vergeeft niet
te mengen.
- Vervolgens wordt aan het zojuist gemeten cuvet (3) 0.01 mL oxamaat (10
mM) toegevoegd. Registreer de fluorescentie-uitlezing en vul deze ook in
tabel 2.2 in (waarneming 3a).
4) NADH fluorescentie bij oplopende lactaat dehydrogenase concentraties
Voor het bepalen van een bindingsconstante zijn een groot aantal metingen
bij een vaste NADH concentratie en variabele LDH concentraties
nodig. Om het pipetteren te verminderen zullen deze waarden virtueel
worden verkregen. De door je gevonden fluorescentie van 4 μM NADH
(de meting van buffer + NADH) en de fluorescentie van 4 μM NADH +
2.13 μM LDH (de meting van 0.03 mL LDH, 2.5 mg/mL + NADH) worden
in het programma LDHEXP ingevoerd. Uw getallen worden gebruikt om
een volledige titratie te simuleren. De gesimuleerde getallen kunnen
worden gebruikt om tabel 2.3 in te vullen.
Incubatie mL LDH
(2.5 mg/mL )
- 34 -
1 0 0.96 buffer 0
2 0 0.96 aceton 0
3 0.03 0.93 buffer 2.14
3a plus 0.01 mL 10 mM
Oxamaat
Tabel 2.2
Fluorescentie van NADH onder verschillende condities
mL buffer/aceton [LDH] μM Fluorecentie toename/afname door
de laatste toevoeging
2.14

Computer
gegenereerde
getallen
(mL LDH)
0 0
0.01 0.71
0.03 2.14
0.06 4.27
0.10 7.12
0.15 10.68
0.21 14.95
0.28 19.94
0.36 25.63
0.45 32.04
0.55 39.16
0.66 46.99
0.78 55.54
[LDH] µM NADH fluorescentie
De NADH concentratie
was steeds
4 μM
Tabel 2.3
Effect van een toenemende LDH
concentratie op de NADH fluorescentie
(computer gegenereerde
getallen).
Additionele gegevens
1) De diëlectrische constante van aceton is 20.7, die van water
80.4.
2) NADH fluoresceert meer in een apolaire omgeving dan in
water.
3) Een functioneel LDH enzym in vivo bestaat uit vier subunits
(H4, H3M, H2M2, HM3 of M4).
4) Het molecuulgewicht van het hier te gebruiken varkenshartspier
enzym is 35112 g per subunit, dus is 2.5 mg/mL 71.2
μM LDH subunits. 10 μL LDH van 2.5 mg/mL in 1 mL geeft een
concentratie van 0.71 μM LDH-subunits.
5) Elke subeenheid heeft een katalytische plaats en bindt één
molecuul NADH, één molecuul pyruvaat of oxamaat.
HET UITWERKEN VAN HET LDH EXPERIMENT (LDH-2)
A) De activiteitsmeting van lactaat dehydrogenase
1) Trek een raaklijn aan extinctiedaling geregistreerd op de
recorderrol. Doe dit voor de vier activiteitsmetingen. Gebruik
het gegeven dat de schaal op de recorder loopt van extinctie
nul naar extinctie 1.
• Bereken uit de absorptiedaling de initiële activiteit van LDH
onder de experimentele omstandigheden van de vier uitgevoerde
activiteitsmetingen. De activiteit moet worden gegeven
in μmol NADH geoxideerd. s -1 . mg LDH -1 . Gebruikt de recordersnelheid
(meestal 3 cm/minuut) om de beginactiviteit uit
te rekenen. Voor de berekening moet je de formule E = ε x c
gebruiken.
De ε voor NADH is 6300 M -1 .cm -1 .
• Vergelijk de metingen van pyruvaat en pyruvaat + oxamaat
bij pH 7.0. Is het mogelijk op basis van bovenstaande uitgerekende
gegevens te bepalen of oxamaat remt en zo ja of oxamaat
een competitieve dan wel een niet-competitieve remmer is?
• Als dit niet mogelijk is welke experimenten moet men dan uitvoeren om
dit wel te kunnen bepalen? Zie Biochemistry (6 de editie p. 226 – p. 227,
5 de editie p. 210).
B) Het bepalen van de standaard vrije energieverandering van de reductie
van pyruvaat tot lactaat door NADH
• Bereken uit de beginextinctie van NADH en de extinctieveranderingen
na toevoegen van LDH concentraties NADH, pyruvaat, lactaat en NAD + in
evenwicht bij pH 7 en pH 8.5 (de experimenten 1, 3 en 4). Gebruik hierbij
de door de assistent bepaalde pyruvaatconcentratie.
• Bereken met behulp van de Excel sheet de standaard vrije energie en de
evenwichtsconstante van de reactie bij pH 7.0 en 8.5.
• Geef aan of de experimenteel berekende constantes in overeenstemming
zijn met de literatuurgegevens die in de Excel sheet gegeven worden.
• Als het experiment niet in overeenstemming is met de theorie, welke additionele
gegevens zijn er dan nog nodig? Denk hierbij aan de zuiverheid
van de gebruikte reagentia, de nauwkeurigheid waarmee de reagentia
- 35 -

kunnnen worden toegevoegd in relatie tot de eindconcentraties van de
reactanten. Geef ook aan welk van de drie experimenten (pH 7.0 en 8.5
gestart met pyruvaat en NADH of het experiment bij pH 8.5 gestart met
lactaat en NAD + ) waarschijnlijk de betrouwbaarste waarde op zal leveren.
C) Het bepalen van de bindingsconstante van NADH aan LDH
Zoals reeds gegeven neemt de fluorescentie van NADH toe als het molecuul
aan het enzym bindt. je kunt aannemen dat de verandering van de NADH
fluorescentie rechtevenredig is met de concentratie LDH-NADH. Daarom
zijn de waarnemingen geschikt om de bindingsconstante te bepalen van
NADH aan LDH. Voorts kunt je aannemen dat de binding van NADH aan een
subeenheid van LDH de binding van NADH aan een andere subeenheid niet
beïnvloedt.
De NADH fluorescentie toename kan uitgedrukt worden als een fractionele
verzadigingsgraad (Y) van de binding van NADH aan LDH:
LDH vrij + NADH vrij LDH-NADH complex
Y = [LDH-NADH] complex / ([LDH-NADH] complex + [NADH] vrij ) (1)
De waarde van Y varieert tussen de fluorescentie van het vrije NADH (geen
LDH aanwezig) en de maximale toename van de fluorescentie als alle NADH
gebonden is (Fluor MAX ) (overmaat LDH). Y varieert dus tussen 0 en 1.
De dissociatieconstante van het LDH-NADH complex is:
K D = ([LDH] vrij *[NADH] vrij )/[LDH-NADH] complex (2)
M.b.v. formule (2) is [LDH-NADH] uit te drukken in [LDH], [NADH] en K D en
in te vullen in (1). Na het delen van de teller en noemer door [NADH] vrij en
vermenigvuldigen met K D ontstaat:
Y= [LDH] vrij / ([LDH] vrij +K D ) (3)
Dit is een formule van een hyperbool en vergelijkbaar met de Michaelis-Menten
vergelijking. Als in plaats van Y de fractionele snelheid van een enzym
(v/V max ) wordt gelezen, is de formule (3) gelijk aan de Michaelis-Menten
vergelijking: v/V max = S / (S+K M ). Maar er is een groot verschil tussen activiteitsmetingen
van een enzym en een bindingsstudie. In de formules zijn
[LDH] en [NADH] de concentraties van de niet-gebonden moleculen. Bij een
activiteitsmeting is de substraatconcentratie vaak vele malen groter dan de
enzymconcentratie en dan is [S] ongebonden ~ [S] toegevoegd . Deze laatste
waarde weet men omdat men die toevoegt aan het incubatiemengsel. In
dit experiment zijn alleen de toegevoegde concentraties van NADH en LDH
bekend. Het probleem is nu te achterhalen welke de [LDH] ongebonden en
[NADH] ongebonden zijn. Deze zijn weer te bepalen als de concentratie van
het LDH-NADH complex bekend is. De vrije concentratie is dan de toegevoegde
concentratie min de gebonden concentratie. Wanneer je dus kans
ziet een relatie te vinden tussen de fluorescentie en de concentratie
van het LDH-NADH complex, kan de K D eenvoudig met de formule (2)
worden uitgerekend.
- 36 -

Gebruik voor de berekening van de dissociatieconstante de Excel-sheet
waarmee de standaard vrije energie is uitgerekend. Kies het tab-blad Kd. In
de sheet wordt een oplossing gegeven voor het numeriek schatten van de
dissociatieconstante. Probeer de Excel-sheet te begrijpen. Indien je er niet
uitkomt overleg dan met de assistent.
C) Het bepalen van de K D van het NADH-LDH complex
• Geef in het verslag de grafiek van de toename van de NADH fluorescentie
bij de verschillende LDH concentraties.
• Geef aan waarom de NADH fluorescentie in aceton hoger is dan in water.
• Bepaal uit de waarden van de toename van de NADH fluorescentie tegen
de oplopende LDH concentratie de dissociatieconstante van NADH en
LDH. Verderop wordt aangegeven hoe deze valt te berekenen. Beargumenteer
in het verslag hoe je de fluorescentie van het LDH-NADH complex
hebt kunnen koppelen aan een concentratie.
• Geef de bepaalde K D en zijn eenheid. Geef ook aan waarom je juist deze
waarde hebt gekozen.
ADDITIONELE INFORMATIE OVER VRIJE ENERGIE VERANDERINGEN EN
REDOX POTENTIALEN
A) Vrije energie en redoxpotentialen
De bestudeerde reactie is:
pyruvaat (A) + NADH (B) + H + lactaat (C) + NAD + (D)
Deze reactie is opgebouwd uit twee redox reacties: pyruvaat wordt gereduceerd
tot lactaat en NADH wordt geoxideerd tot NAD + .
pyruvaat + 2e + 2H + lactaat
NADH NAD + + 2e + H + .
Voor het berekenen van het redoxpotentiaal verschil, de vrije energieverandering
van de reactie en de evenwichtsconstante is een Excel sheet op de
site van dit vak (http://biochemistry.wur.nl/practicum_Biologische_Chemie/
index.html) aanwezig. Gebruik deze Excel sheet bij het beantwoorden van de
vragen.
De relatie tussen de vrije energie en de redox potentiaal wordt in Biochemistry
(6de editie p. 506 – p. 509, 5de editie p. 494 – p. 496) behandeld. Deze
relatie is relatief simpel ΔG = - nFΔE. n = het aantal electronen die bij de
redox reactie betrokken is, F is de Farady constante. R is de gasconstante en
T is de temperatuur in graden Kelvin. De relatie geldt ook voor de standaard
vrije energie en standaard redox potentiaal.
Dus ΔG = ΔG 0 + RTln( [C].[D]/[A].[B].[H + ]) -
nFΔE = - nFΔE 0 + RTln( [C].[D]/[A].[B].[H + ]).
Deel door -nF.
- 37 -

ΔE = ΔE 0 - (RT/nF) x ln( [C].[D]/[A].[B]. [H + ]).
Dit is de wet van Nernst. Als je de [H + ]-term uit de logaritme haalt, de ln omzet
in een 10log (factor 2.3) en bij 20 °C werkt wordt de RT/nF ln term 0.0591/
n log. De Nernst formule wordt dan:
ΔE = ΔE 0 - 0.0591/n x log (1/[H + ]) - 0.0591/n x log( [C].[D]/[A].[B]).
De ΔE 0 geldt voor een [H + ] van 1 M dus pH = 0. In de biochemie worden de
standaard redox potentialen vaak bij pH = 7 gegeven. De H + -afhankelijke
term is dan in de E 0 verwerkt. Als er in een redox reactie één proton of meerdere
protonen (het aantal protonen = p) zijn betrokken dan beinvloedt de
pH de niet-concentratie term volgens de volgende formules
ΔE 0 - 0.0591/n x log (1/[H + ] p ). pH = -log[H + ].
ΔE 0 - 0.0591/n x p x pH
De concentratie onafhankelijke term van het redoxkoppel pyruvaat/lactaat
neemt 0.059 V per pH eenheid af (p = 2 en n=2) en dat van het redox koppel
NAD + /NADH 0.0295 V per pH eenheid (p = 1 en n=2). In de Excel sheet
die beschikbaar is via de internet site van dit vak (Blackboard of http://biochemistry.wur.nl/pbc/index.html)
worden de hierboven behandelde redox
reacties via berekeningen nader toegelicht. Voorts bevat de Excel sheet een
voorbeeldberekening van de vrije energie van de reactie. Deze kan gebruikt
worden om de experimentele data in te voeren van de door je bepaalde
evenwichtsconcentraties. De verkregen ΔG 0 kan dan vergeleken worden
met de theoretische ΔG 0 die uit de standaard redox potentialen volgt.
COMPUTER GRAPHICS VAN LDH (LDH-3)
Er wordt van uitgegaan dat je het theoretisch deel van deze proef heeft
bestudeerd. De onderstaande opdrachten moet je uitvoeren via het programma
“Swiss pdb Viewer” dat op de computers die op de practicumzaal
staan, aanwezig is. Indien je dit experiment nog eens wilt herhalen, kunt je
de benodigde files via de Internet site van dit practicum ophalen.
Hieronder staat een beknopte handleiding van de Swiss pdb Viewer waarin
wordt aangegeven hoe men de verschillende opdrachten kan uitvoeren. Na
de hand van de resultaten op het scherm bent je in staat de gestelde vragen
in het verslag te beantwoorden.
Het bekijken van de structuur van eiwitten met het programma Swissview
op de PC. Zorg ervoor dat het Control Panel aanwezig is. Dit kan
tevoorschijn geroepen worden via de tab ‘Window’ als er een pdb file is
geladen.
- Het op het scherm zetten van een structuur: klik op ‘File’, ‘Open PDBfile’.
De files met de structuren (extensie pdb) bevinden zich in de practicumcomputers
in de directory D:\practicum of elders. De moleculen
worden weergegeven als een draadstructuur gekleurd naar atoomtype.
- 38 -

- Het werken met het Control panel: haal het Control panel te voorschijn
door op ‘Window’, ‘Control panel’ te klikken. Hierin staat de sequentie met
een aantal attributen. Let op: als je meerdere structuren in één scherm
hebt geladen, geeft de naam linksboven in het Control panel aan welke
structuur actief is. Als je op die naam klikt, krijg je een lijst met alle geladen
structuren en kun je een andere selecteren dan de actieve structuur.
Een vinkje in het hokje ‘visible’ onder de naam geeft aan of een structuur
zichtbaar is; door hierop te klikken kun je een structuur laten verdwijnen.
Je kunt aminozuren of andere residuen selecteren in de lijst door op de
naam te drukken met de linker muistoets. Een geselecteerd aminozuur
wordt rood weergegeven in de lijst. Met de ‘Ctrl’ of ‘Shift’ toets ingedrukt
kun je meerdere residuen selecteren.
- Het kleuren van een (deel van een) molecuul: a) klik op ‘Color’ en kies
een optie, bijv.: ‘by CPK’: deze optie kleurt op atoomtype (CPK-kleuren:
wit: C; blauw: N; rood: O; geel: S); ‘by layer’: hiermee kan je een verschillende
kleur aan twee over elkaar geprojecteerde moleculen geven. b)
voor het kleuren van een deel van een molecuul of een afzonderlijk
aminozuur/ cofactor: zoek de residuen die je wilt kleuren (bijv. NAD) op
in het Control panel (let op als je meerdere structuren geladen hebt dat
de goede structuur actief is), klik op het blokje achter de naam van het
residu. Op het scherm dat verschijnt kun je nu een kleur kiezen.
Om de kleurinstelling van een item ongedaan te maken, moet het item
worden geselecteerd en het kleurinstelwindow zonder selectie via het
indrukken van de enterknop worden afgesloten.
- Het maken van een Stick of CPK structuur: ‘Ball-and-Stick’ is niet mogelijk,
wel een ‘stick’ structuur. Klik op ‘Display’, ‘Use Open GL rendering’
en daarna nog eens op ‘Display’, ‘Render in solid 3D’. Beide opties zijn nu
‘aangevinkt’. ‘CPK’ (of ‘Van der Waals’) structuur kan worden weergegeven
door in het Control panel achter de naam van een residu met de linker
muisknop te klikken in de kolom gemerkt ‘::ν’. (dit werkt alleen als ‘Use
Open GL rendering’ en ‘Render in solid 3D’ geselecteerd zijn). Klikken met
de ‘Shift’ knop ingedrukt geeft alle residuen als CPK weer.
- Het verplaatsen/inzoomen/roteren van structuren op het scherm:
dit gebeurt met de tweede t/m vierde knop van de knoppenbalk. Hand:
verplaatsen; vierkant: in/uitzoomen; gebogen pijl (default): draaien. De
beweging wordt uitgevoerd door de muis te bewegen met de linker
muisknop ingedrukt (N.B.: de cursor moet zich bevinden in het scherm
waarin de afbeelding staat). Als je structuur ‘kwijt’ bent, klik dan op de
meest linkse knop in de knoppenbalk. De structuur verschijnt dan weer
midden op het scherm.
- Het identificeren van atomen: klik op de achtste knop van de knoppenbalk
(met plaatje ‘Leu 41 ?’). Klik vervolgens op een atoom in de structuur.
Je krijgt dan iets als ‘Met54CE’ op je scherm. Dit betekent dat je hebt geklikt
op het C-ε atoom van aminozuur 54, een methionine. Om de labels
weer te verwijderen: klik op ‘Display’, ‘Label kind’, ‘Clear user labels’.
- Het meten van afstanden tussen atomen: klik op de vijfde knop van de
- 39 -

knoppenbalk (plaatje ‘1.5 Å’). Klik vervolgens op een atoom in de structuur.
Klik daarna op een tweede atoom, en de afstand tussen de atomen
verschijnt op het scherm (Let op de dialoog in rood die onder de knoppenbalk
verschijnt ! Soms heb je net iets naast een atoom geklikt en is er
niets geselecteerd). Om de labels weer te verwijderen: klik op ‘Display’,
‘Label kind’, ‘Clear user labels’.
- Het weergeven van de polypeptide backbone als een ribbon structuur:
Zorg ervoor dat ‘Use Open GL rendering’ in de ‘Display’ scrollbar
geselecteerd is. Houd daarna de ‘Shift’ toets ingedrukt en klik in het
Control panel ergens in de kolom ‘ribn’ (de kolom voor de blokjes). Om
de backbone en de zijketens van het scherm te halen met de ‘Shift’ toets
ingedrukt klikken in de kolommen ‘show’ en ‘side’ van het Control panel.
Ribbons of andere structuurelementen kunnen van een kleur worden
voorzien door eerst via het rechter ‘driehoekje’ ribbons te selecteren.
Daarna wordt via de ‘col’ kolom de selecteerde items, in dit geval ribbons,
gekleurd. Via deze methode is het mogelijk de ribbons van over
elkaar geprojecteerde structuren een verschillende kleur te geven. Naast
ribbons kunnen alle onder het rechter ‘driehoekje’ teken staande items
geselecteerd en gekleurd worden.
Let op: het is niet mogelijk om in een ribbonstructuur aminozuren te
identificeren of afstanden te bepalen. Dit kan wel als naast de ribbon ook
de backbone is geselecteerd (vinkjes in de eerste kolom).
- Gedeelten van een structuur van het scherm halen of er juist opzetten:
dit kan gedaan worden door de vinkjes in de kolommen ‘show’ en
‘side’ in het Control panel te verwijderen of weer terug te zetten. Dit kan
voor het hele molecuul tegelijk (door de ‘Shift’ toets ingedrukt te houden),
voor gedeelte of voor aparte aminozuren/co-factoren. Een vinkje in
‘side’ heeft alleen effect als er ook een vinkje in ‘show’ staat. N.B.: NADH en
oxamaat staan alleen in de structuur van ldh2, en wel helemaal onder in
de lijst, na de aminozuren. De drieletterige afkorting van NADH is NAD,
en die van oxamaat is OXM.
- Het verwijderen van een structuur: ‘File’, ‘close’
- Het maken van een schermafdruk: Via de optie File, Save, Image kan
een bitmap van het scherm gemaakt worden. Deze file wordt op het
gebied C:\Biochemie\practicum Biologische Chemie gezet. Geef als
filenaam bijvoorbeeld groep6-opdracht1. Deze files worden later door de
assistent bekeken en zijn via een foto-editing programma uit te printen.
Maak naast de bitmap-files ook aantekeningen van wat je ziet om de
vragen te kunnen beantwoorden.
- Manual: klik op ‘Help’, ‘Local manual’ voor een toelichting op de opties
van het programma
- 40 -

OPDRACHTEN EN VRAGEN CG EXPERIMENT (LDH-3)
Opdracht 1: het bepalen van de toegankelijkheid van het katalytisch
centrum van LDH vanuit de oplossing
- Zet de ldh2 structuur op het scherm
De gegevens hiervoor zijn aanwezig in de file ldh2.pdb. Dit is een tekstfile
met de coördinaten van alle zichtbare (=X-ray verstrooiende) atomen in
het kristal van haaispier ldh met NADH en oxamaat gebonden. Waterstofatomen
zijn in de structuur niet zichtbaar omdat ze niet voldoende X-rays
verstrooien. Oxamaat is een structuuranaloog van pyruvaat. De -CH3
groep van pyruvaat is in oxamaat een -NH2 groep. Oxamaat bindt op de
plaats van pyruvaat maar de ketogroep van oxamaat kan niet door NADH
gereduceerd worden. Zie ook de activiteitsmeting van LDH.
- Tracht het katalytisch centrum in het eiwitmolecuul te vinden. Dit kan
door NADH en oxamaat op te zoeken. Dit gaat gemakkelijker door NADH
en oxamaat een exotische kleur te geven en ze met de ‘stick’ optie of de
CPK optie weer te geven. Zoek de structuurformules van NADH, pyruvaat,
lactaat en oxamaat op.
- Draai het molecuul nu zodanig dat NADH en oxamaat zoveel mogelijk
van ‘bovenaf’ zichtbaar zijn. Geef hierna de opdracht om alle atomen met
hun van der Waals omvang weer te geven. Als je niet weet wat ‘van der
Waals’ omvang betekent zoek het dan op in een (Biochemie) boek.
Vraag 1
Je bent nu in staat de vraag te beantwoorden of het katalytisch centrum
direct vanuit de oplossing bereikbaar is voor de substraten van het enzym.
- Van het scherm wordt nu een afdruk gemaakt via het wegschrijven van
een ‘screendump-file’. Dit gaat via een ‘File, save, Image’ opdracht. Deze en
de andere schermafdrukken moeten naar de assistent via de email worden
opgestuurd. Geef je file een duidelijke naam. Bijvoorbeeld groep1-afdruk1.
- Na deze handelingen wordt de structuur van het scherm verwijderd.
Opdracht 2: het effect van de substraatbinding op de conformatie van
LDH
- Zet nu de ldh1 structuur op het scherm. Beweeg tussendoor de ldh1
structuur niet. ldh1 is het haaispier enzym zonder gebonden substraten.
Vervolgens wordt de ldh2 structuur opgehaald en over de ldh1 structuur
heen geprojecteerd. ldh2 is het enzym met NADH en oxamaat gebonden.
- De conformatie van een eiwit kan het meest inzichtelijk op het scherm
worden getoond door alleen de loop van de polypeptide keten weer te
geven. Doe dit voor LDH1 en LDH2. Maak ook de plaats van het katalytisch
centrum zichtbaar. Dit gaat door NADH en oxamaat met hun van der
Waals omvang in de LDH2 file weer te geven.
Gebruik de informatie die je nu op het scherm ziet om de onderstaande
vragen te beantwoorden.
Vraag 2
a) Beschrijf het effect van de binding van NADH en oxamaat op de conformatie
van het eiwit
- 41 -

) Welk gedeelte van het eiwit (zoek de nummers van de aminozuurresiduen
op in de structuur) verandert het meeste van conformatie? Deze
conformatieovergang is de snelheidsbepalende stap in de katalyse en
is aangegeven in het schematische figuur van de katalytische cyclus
van LDH (zie theoriedeel).
- Maak van het scherm een file via een ‘File, save, Image’ opdracht.
Opdracht 3: het bestuderen van het katalytisch centrum van LDH
- Zet de file kc.pdb op het scherm. In deze file zijn alleen de belangrijkste
aminozuren van de NADH en oxamaat bindingsplaatsen weergegeven.
Alle andere aminozuren zijn weggehaald uit de oorspronkelijke ldh2.
pdb file. Dit is gedaan om de interacties tussen NADH en oxamaat met de
aminozuurresiduen goed te kunnen zien.
- In het katalytisch centrum treft je de volgende aminozuren aan: Val31,
Arg106, Asp166, Arg169, His193 en Ile249. In het theoriedeel is aangegeven
welke eigenschappen van LDH veranderd zijn wanneer genoemde
aminozuren worden omgezet in de aangegeven aminozuren. Het is zeer
nuttig om bij de beantwoording van de vragen de structuur en functionele
eigenschappen van de genoemde aminozuurresiduen paraat te
hebben. Deze zijn te vinden in Biochemistry (6de editie, hoofdstuk 2, 5de
editie hoofdstuk 3).
Om te zien met welke atomen je te maken heeft is het handig om de
atomen te kleuren in de standaardkleuren. Maak een ‘Stick’ afbeelding en
manipuleer de structuur zodanig dat je een zo goed mogelijk overzicht
heeft over de verschillende aminozuurresiduen.
- Van het scherm wordt via een ‘File, save, Image’ opdracht een file gemaakt.
Vraag 3
Wat is de afstand tussen de C4 van NADH (vanaf dit C-atoom wordt een
hydride naar pyruvaat overgedragen) en de C1 van oxamaat (oxm2 C1)?
Zou deze afstand klein genoeg zijn voor de overdracht van een hydride?
Hierbij moet je je realiseren dat er een overlap van de moleculaire orbitalen
moet plaatsvinden voordat er een reactie kan plaatsvinden. De
globale straal (> 95% van de electronen bevinden zich binnen deze straal)
van de elektronenwolken rondom een aantal groepen is in Å (10 -10 m):
-OH, 1.4; -NH 2 , 1.5; -CH 2 -, 2.0; -CH 3 , 2.0; -C=O, 2.0. De straal rondom atomen
is: H, 1.2; C, 1.7; N, 1.5; O, 1.4; S, 1.8; P, 1.9.
Vraag 4
a) Welke aminozuurresiduen of residu zijn (is) betrokken bij de binding
van oxamaat (pyruvaat)?
b) Tot welke categorie zou je deze binding(en) rekenen?
c) Welke binding zou het meeste vrije energie geven? Zoek de bindingsenergiën
op in Biochemistry. Vraag je af of er veel water moleculen in
het katalytisch centrum aanwezig kunnen zijn.
Vraag 5
Welk aminozuurresidu in het katalytisch centrum is in staat een proton
te leveren of op te nemen bij neutrale pH? Dit proton is nodig voor de
protonering van de ketogroep van pyruvaat of moet worden opgenomen
bij de deprotonering van de hydroxygroep van lactaat. Deze groep is es-
- 42 -

Figuur 2.8
De overgangstoestand voor de
reversibele reductie van pyruvaat
door NADH
sentieel voor de katalyse.
Vraag 6
De pKa van het aminozuurresidue dat een proton zou kunnen leveren is
mogelijk te laag om bij pH waarde van 7.5 en hoger voldoende geprotoneerd
te zijn. Welk aminozuurresidu is in staat de pKa van het protonleverende
aminozuurresidue naar hogere waarden te verschuiven?
Vraag 7
Welke aminozuurresiduen zouden de overgangstoestand stabiliseren?
Anders gezegd welke aminozuurresiduen induceren een polarisatie in de
carbonylbinding van pyruvaat/oxamaat.
Vraag 8
Zijn er in de structuur apolaire aminozuurresiduen te vinden in het
bindingsoppervlak van NADH? Deze micro-omgeving van NADH op het
enzymoppervlak verklaart de toename van de NADH fluorescentie door
binding.
Vraag 9
Kunt je een verklaring geven voor de afname van de NADH fluorescentie
nadat oxamaat is gebonden aan het NADH-LDH complex? Zie het NADH
fluorescentie experiment. Tip: NADH is fluorescent en NAD + niet.
Slotopmerking
Door middel van de uitgevoerde opdrachten en het beantwoorden van de
vragen hopen we dat je gezien heeft hoe de aminozuurresiduen van een
eiwit specifieke interacties met het coenzym (cosubstraat) en het substraat
aangaan bij binding van genoemde moleculen. Door deze interactiemogelijkheden
is een eiwit in staat de reactanten als het ware specifiek te solvateren,
te omringen met aminozuurresiduen in plaats van watermoleculen.
Mede hierdoor worden de twee substraten op het enzymoppervlak zeer pre-
- 43 -

cies ten opzichte van elkaar gelokaliseerd. Daarnaast heeft het eiwit via een
geprotoneerde histidine een proton beschikbaar dat nodig is om de ketogroep
van pyruvaat te protoneren tijdens de hydride aanval op het C 2 atoom
van pyruvaat. Verder stabiliseert het enzym de overgangstoestand voor de
zo juist beschreven reactie en verlaagt de vrije energie van de thermodynamische
‘drempel’ van de reactie. Door al deze interacties is de reversibele
reductie van pyruvaat door NADH mogelijk.
VERSLAG
In vivo fluorescentie
• Maak een tabel van de waarden van de absorptiemetingen tegen de
NADH concentratie.
• Geef de berekening van de concentratie van de verstrekte NADH oplossing.
Middel de getallen als ze reëel zijn.
• Bereken voor uw oplossing gelabeld 0.1 mM NADH welk percentage van
het licht door NADH geabsorbeerd wordt.
• Maak een grafiek van de NADH absorptie en de fluorescentie tegen de
NADH concentratie. Realiseer je dat het punt 0,0 ook een meetpunt is.
Verklaar waarom de lijn van de fluorescentie tegen de NADH concentratie
niet recht is en die van de extinctiemetingen wel.
• Is het mogelijk bij hogere concentraties NADH procentueel minder
quenching te krijgen door de intensiteit van het exciterende licht op te
voeren?
• Wat gebeurt er met de totale fluorescentie als de intensiteit van de lamp
wordt opgevoerd?
• Nu je de vragen over absorptie en fluorescentie hebt beantwoord wordt
je geacht enig begrip van beide methoden te hebben. Kan je aangeven
met welke methode gevoeliger te meten valt. Geef aan waarop je je uitspraken
baseert.
• Geef een gedetailleerde verklaring voor de veranderingen van de
NAD(P)H fluorescentie van de gistcellen in de tijd. Wat kunt je zeggen
over de K M waarde van het enzym dat in de glycolyse NAD + omzet in
NADH en het enzym dat NADH weer oxideert tot NAD + . Je mag aannemen
dat in het begin van het experiment er nagenoeg geen NADH
aanwezig is. Alle endogene substraten die NAD + kunnen reduceren zijn
uitgeput tijdens de hongerperiode.
• Bepaal uit de fluorescentiemeting na hoeveel seconden na het toevoegen
van de gistcellen aan het medium de gistcellen overschakelen van
een aeroob naar een anaeroob metabolisme (de NADH concentratie in
gistcellen neemt dan sterk toe). Bij welke zuurstofconcentratie vindt dit
plaats? Met andere woorden beneden welke zuurstofconcentratie wordt
cytoplasmatisch NADH niet meer effectief geoxideerd door de ademhalingsketen
van de mitochondriën? Voor de berekening van de zuurstofconcentratie
mag er van worden uitgegaan dat deze 230 μM was in de
gebruikte fosfaatbuffer.
LDH en Computer Graphics
• Presenteer de berekeningen en de antwoorden op de gestelde vragen bij
beide experimenten.
- 44 -

Figuur 3.1
Kristallen van natriumuraat
veroorzaken
gewrichtsontstekingen,
die meestal in
de grote teen beginnen.
GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMENTEN VAN BLOK 3
De experimenten van blok 3 hebben de kwantitatieve analyse met behulp
van enzymen als gemeenschappelijk factor. Het eerste deel zal bestaan uit
experimenten die voorbeelden zijn van biochemische analysemethoden in
de klinische chemie. Met behulp van enzymen zal de concentratie van urinezuur
in urine worden bepaald. Daarnaast zal de activiteit van aminotransferases
in serum worden bepaald. Deze gegevens ondersteunen een diagnose
over het verloop van een hartaanval of leverziekte.
Naast klinisch chemische
experimenten is de theorie
van electroforese en
die over isoenzymen een
leerelement in dit blok.
Experimenteel zal de aanwezigheid
van isoenzymen
worden aangetoond met
behulp van een isoelectrischfocusseringsexperiment.
Figuur 3.2 Het purine katabolisme.
Purine basen worden eerst omgezet in xanthine en daarna in urinezuur. Xanthine oxidase katalyseert
twee reacties in het proces.
- 45 -

URINEZUURBEPALING
Doel van het experiment
Het doel van deze proef is om de concentratie urinezuur in urine volgens
twee methoden zo nauwkeurig mogelijk te bepalen. Hierbij zal geoefend
worden in het gebruik van een zuurstofelectrode en vormt het uitwerken
van de spectrofotometrische en polarografische experimenten een leerdoel
op zichzelf.
Inleiding
Urinezuur is het product van de purine nucleotide afbraakroute
in mensen. Mensen missen het enzym uricase
dat het slecht oplosbare urinezuur omzet in het beter
oplosbare allantoine. Te hoge concentraties van urinezuur
geven aan dat er iets niet in orde is met het purine metabolisme
of de afvoer via de nieren. Jicht is een ziekte die
veroorzaakt wordt door een te hoge urinezuurconcentratie.
In vroegere tijden werd jicht geassocieerd met overdadig
eten en drinken. Deze personen dronken veel wijn
uit loden bekers en kregen een loodvergiftiging. Hierdoor
werkten onder meer de nieren niet meer goed en werd
urinezuur niet efficiënt uitgescheiden. Daarnaast zijn er
een aantal nog niet opgehelderde metabole stoornissen
waarbij een te hoge purineproductie de oorzaak is van
een te hoge urinezuurvorming. Verder zijn er verschillende
ziektes/medische behandelingen bekend die een te hoge
urinezuurproductie tot gevolg hebben. Bijvoorbeeld bij
bestraling wordt er veel DNA afgebroken en dit heeft dan
een sterkverhoogde purinedegradatie en urinezuurvorming tot gevolg. De
stof, allopurinol, is een remmer van xanthine oxidase en wordt gebruikt om
de urinezuurproductie te beperken via de remming van het enzym xanthine
oxidase. Ontstekingsremmers worden gebruikt om de pijnlijke gevolgen van
de natriumuraatkristallen in de gewrichten te verminderen.
Er is een medische discussie over de limieten van een urinezuurtest. De
concentratie van urinezuur in het bloed varieert sterk van dag tot dag en
gedurende het jaar. Verhogende factoren zijn een eiwitrijk dieet met vooral
veel orgaanvlees, sardines, ansjovis en alcohol. Daarnaast wordt de urinezuurconcentratie
verhoogd door vasten en extreem sporten. Boven 0.42 mM
urinezuur in het serum spreekt men van hyperuricemia. Als de urinezuurconcentratie
hoger wordt dan 0.48 mM slaat natriumuraat neer in de weefsels.
In de urine worden bij mannen waarden tussen de 1 en 4 mM uraat (het
gedeprotoneerde urinezuur, pKz = 5.8) gevonden. De waarden bij vrouwen
zijn iets lager.
Het principe van de zuurstofelectrode
Een zuurstofelectrode is een speciale electrochemische cel. De cel is van de
oplossing gescheiden door een plastic membraan dat alleen doorlaatbaar is
voor gassen. De electrode bestaat uit twee draden. Een platina- en een zilverdraad
die beide in een KCl oplossing steken. Er wordt tussen de electrodes
een potentiaal van 0.6 V aangebracht. De platina-electrode krijgt een negatieve
spanning ten opzichte van de zilver-electrode. De reacties die optreden
staan in figuur 3.4 weergegeven.
- 46 -
Figuur 3.3
De vorming van allantoïne uit
urinezuur.

Figuur 3.4
De electrode reacties van een
zuurstofelectrode.
Figuur 3.5
De temperatuursafhankelijke
oplosbaarheid van zuurstof (in
mM) in water bij een luchtdruk
van 760 Torr.
Figuur 3.6
De luchtdrukafhankelijke
oplosbaarheid van zuurstof (in
mM) in water van 30°C.
Zoals in het schema wordt aangegeven loopt er een stroom door de cel die
rechtevenredig is met de hoeveelheid
O2 die in de cel aanwezig is.
Door de electrode reacties is de O2
concentratie in de cel nagenoeg nul.
Hierdoor zal O2 vanuit de oplossing
de cel in diffunderen. Deze
diffusie is rechtevenredig met de O2
concentratie in de oplossing. Dus
vlak bij het membraan neemt de
O2 concentratie af. Door te roeren
wordt de O2 concentratie rond het
membraan aangevuld en wordt de
diffusiesnelheid naar de electrochemische cel bepaald door de O2 concentratie
in de oplossing. Omdat de oplosbaarheid van O2 in H2O bij een groot
aantal temperaturen bekend is, is de electrode eenvoudig te ijken door H2O
gethermostateerd te roeren. In figuur 3.5 is de oplosbaarheid van zuurstof
in water bij verschillende temperaturen en bij een vaste luchtdruk van 760
mmHg weergegeven.
Daarnaast bepaalt de luchtdruk de
hoeveelheid O2 die opgelost is. Deze
varieert maximaal 10% in Nederland.
De luchtdruk is via het internet te
vinden op www.weer.nl of www.met.
wau.nl (meteostation Haarweg).
Let goed op dat er onder de dop
geen luchtbellen aanwezig zijn. Deze
verstoren de meting omdat er dan
vanuit de luchtbellen zuurstof het
reactiemengsel in diffundeert waardoor
een lagere zuurstofconsumptie
wordt gemeten.
- 47 -

Bepalingsmethode
De reacties zijn:
1) Urinezuur + 2H 2 O + O 2 allantoine + H 2 O 2 + CO 2
uricase
2) H 2 O 2 + methanol 2H 2 O + formaldehyde
katalase
3) formaldehyde + 2 acetylaceton + NH 3
3,5 diacetyl-1,4-dihydrolutidine (DDL) + 3 H 2 O
De hoeveelheid urinezuur kan kwantitatief bepaald worden door de vorming
van DDL te meten of door het O 2 gebruik te registreren.
DDL BEPALING
De urinezuurconcentratie kan gemeten worden door DDL te synthetiseren
en de gevormde hoeveelheid spectrofotometrisch te bepalen.
Het experiment wordt in duplo uitgevoerd. Pipetteer volgens het schema de
oplossingen in schone en krasvrije 3 mL plastic cuvetten. Meng de inhoud
van de cuvetten en incubeer de met parafilm afgesloten cuvetten 1 uur bij
30 °C en meet daarna de extinctie bij 410 nm tegen een cuvet gevuld met
H 2 O. Zorg ervoor dat de cuvetten droog zijn.
ZUURSTOFMETING
Via een polarografische meting van zuurstof in een oplossing is een kwantitatieve
urinezuurbepaling mogelijk. Dit gaat m.b.v. een O 2 electrode.
- Bestudeer eerst de theorie over de werking van een polarografische zuurstofelectrode.
- Kalibreer de electrode door het meetvaatje met 3 mL H 2 O te vullen en
te roeren zonder dop, totdat de uitlezing van de electrode niet meer
- 48 -
1 2 3 4 5
Urinezuurbepalingsmengsel 2.5 mL + + + + +
Urine (10x verdund met H 2 O) 0.25 mL - + + - -
Water 0.25 mL + - - - -
0.2 mM urinezuur in H 2 O 0.25 mL - - - + -
0.4 mM urinezuur in H 2 O 0.25 mL - - - - +
Uricase (2.5 mg/mL) 0.02 mL + - + + +
Tabel 3.1
Het pipetteerschema voor de
kwantitatieve urinezuurbepaling
m.b.v. de DDL synthese .

Figuur 3.7
Structuur van acetylaceton
en DDL.
verandert. De temperatuur staat op 30 ºC ingesteld. Nadat de barometerstand
(=luchtdruk) is opgezocht op het Internet (www.met.wau.nl), is
de hoeveelheid opgeloste zuurstof bij 30 ºC uit grafiek 3.6 te bepalen. De
luchtdruk wordt weergegeven in kPa. 1 kPa = 7.5 mm kwikdruk (Torr).
- Vul de reactiekamer met 2.5 mL urinezuurbepalingsmengsel. Voeg
daarna 0.1 mL onverdunde urine toe. Sluit de vloeistof af met de dop en
zorg ervoor dat alle luchtbelletjes uit het reactievaatje in het capillaire
verdwenen zijn. Volg de O 2 concentratie gedurende 5 minuten.
- Start de reactie door 0.02 mL uricase met een ‘Hamilton’ spuit door het
gaatje in de dop toe te voegen. Let op dat je geen gat in het membraan
prikt!. Volg de O 2 concentratie totdat alle urinezuur geoxideerd is.
- Herhaal de meting met 0.05 mL urine .
- Bepaal het exacte gehalte van de gebruikte urinezuurstandaard. Pipetteer
2.5 mL urinezuurbepalingsmengsel en 0.25 mL urinezuurstandaard
(± 0.4 mM) in het reactievaatje van de oxygraaf. Vervolg het experiment
zoals hierboven is aangegeven.
Samenstelling urinezuurbepalingsmengsel
Oplossing 1 Ammoniumfosfaat pH 7.0, (0.6 M) + Methanol (1.7 M) 50 mL
Oplossing 2 Acetylaceton (20 mM) 2.5 mL
Oplossing 3 Katalase 20 mg/mL (1000U/mL) 0.05 mL
- 49 -

KLINISCHE ENZYMACTIVITEITEN
Het doel van het experiment
Het nauwkeurig kunnen uitvoeren van een gekoppelde spectrofotometrische
enzymactiviteitsmeting en het kunnen interpreteren van de juistheid
van het verkregen resultaat door een vervolgexperiment uit te voeren. Daarnaast
wordt geoefend in het omzetten van een meerresultaat (vakjes op een
recorder) naar enzymunits (μmol.min -1 .L serum -1 ).
Inleiding
De cellen van hogere organismen zijn sterk gedifferentieerd en zijn gegroepeerd
in weefsels met specifieke functies. Deze specialisatie wordt door het
cellulaire enzympatroon bepaald. Van het feit, dat cellen enzymologisch te
karakteriseren zijn, wordt in de klinische chemie veelvuldig gebruik gemaakt.
Bij ziekte sterven cellen af en lyseren. De inhoud van de cel komt in het bloed
terecht. De meting van weefselspecifieke enzymen in het bloed kan de medicus
helpen een objectieve diagnose te stellen. Vragen zoals “welke orgaan
is beschadigd, wat is de omvang van de beschadiging en hoe verloopt het
herstellingsproces?” kunnen mede door enzymactiviteitsmetingen beantwoord
worden. In deze proef zal in serum de activiteit van glutamaat oxaloacetaat
transaminase (GOT) en glutamaat pyruvaat transaminase (GPT) getest
worden. De absolute grootte en de verhouding van deze enzymactiviteiten
geeft informatie over het functioneren van hart en lever.
Achtergrond informatie
Twee veel toegepaste indicatorenzymen voor het functioneren van lever en
hart zijn het glutamaat oxaloacetaat transaminase (GOT) en glutamaat pyruvaat
transaminase (GPT). Beide zijn enzymen die onder meer in het cytoplasma
voorkomen en dus bij beschadiging van het celmembraan relatief snel in
de bloedbaan terechtkomen. Ook komen beide enzymen nagenoeg in alle
lichaamscellen voor. Maar er is wel een verschil in concentratie. In hartcellen
is de GOT concentratie relatief hoog en in levercellen is de GPT concentratie
relatief hoog. Als iemand een hartinfarct heeft gekregen stijgt in 95% van de
gevallen binnen 4-6 uur de GOT activiteit in het serum tot 30 U/l (1 U/l = een
μmol substraat omgezet.min -1 .l -1 serum). Na 24-48 uur wordt het maximum
bereikt (50-150 U/l) dat indicatief is voor de omvang van het getroffen gebied.
Na 4-7 dagen zakt de GOT activiteit weer naar normale waarden. Dit is
een maximum van 12 U/l.
Het GPT kan beschouwd worden als een indicator voor sterfte van levercellen.
Bij gezonde mensen is de GPT activiteit lager dan 12 U/l, bij een chronische
leverontsteking is GPT > 20 U/l en bij een acute hepatitis of vergiftiging
worden waarden tussen 150 en 500 U/l gevonden. Ondanks dat de concentratie
GOT in levercellen relatief laag is, kan een verhoogde GOT activiteit
(150-500 U/l) ook veroorzaakt worden door een massale leversterfte zoals
wordt waargenomen bij een acute hepatitis. Dit wordt veroorzaakt door het
feit dat het GPT in levercellen alleen in hoge concentratie in het cytoplasma
voorkomt, terwijl het GOT in zowel het cytoplasma als in de mitochondriën
voorkomt. Als cellen meer dan alleen maar beschadigd worden, maar volledig
lyseren komt ook de inhoud van de mitochondriën in de bloedbaan
terecht. Vandaar dat men om te kunnen discrimineren tussen sterfte van
hartcellen of levercellen, altijd beide transaminases moet meten. Als naast
- 50 -

een verhoging van de GOT activiteit ook de GPT activiteit verhoogt is, duidt
dit op een levercelsterfte. Bij gezonde mensen is de verhouding GOT/GPT ≈
1.3 (DeRitis- quotiënt). Bij een hartaanval is GOT/GPT > 1.3 en bij een leverziekte
is GOT/GPT < 1.3.
GOT EN GPT METINGEN
Uitvoering van de GOT activiteitsmeting
Reagentia:
Buffer/aspartaat oplossing: 0.1 M Na fosfaat pH 7.4; 40 mM L-aspartaat (Asp)
10 mM NADH
0.25 mg/mL malaatdehydrogenase (MDH)
α ketoglutaraat (0.25 M) (α-keto)
- Voordat je begint met pipetteren moet je weten hoe de spectrofotometer
(de UltroSpec II van LKB) met recorder werkt. De extinctieveranderingen
worden bij 340 nm gemeten.
- Pipetteer in een glascuvet met een werkbaar volume van 1 mL :
Asp-buffer 0.60 mL
MDH 0.01 mL
Serum 0.4 mL
- Meng de inhoud van het cuvet en incubeer het cuvet 5 min bij 30°C.
- Plaats het cuvet in de spectrofotometer.
- Stel de spectrofotometer in op 0 door op “set ref” te drukken.
- Voeg nu 0.01 mL NADH toe meng en meet de extinctie.
- De reactie wordt gestart door 0.04 mL α-ketoglutaraat toe te voegen.
Meng en plaats het cuvet snel in de spectrofotometer en volg op de recorder.
- Wanneer de extinctieverandering groter is dan 0.15 per min, moet de
activiteitsmeting worden overgedaan met een vijf keer verdund serumpreparaat.
- Voorts moet gecontroleerd worden of de detectiereactie snel genoeg verloopt.
Bedenk hiervoor een experiment en overleg het met de assistent
voordat je de proef werkelijk uitvoert.
Uitvoering van de GPT meting
De procedure voor de GPT activiteitsmeting is precies hetzelfde als die van
de GOT meting behalve dat de buffer en het detectieenzym verschillend zijn.
Voer ook een controle experiment uit op de snelheid van de detectiereactie
in relatie tot de gemeten activiteit.
Reagentia:
Buffer/alanine: 0.1 M Na fosfaat pH 7.4, 40 mM L-alanine (Ala)
NADH (10 mM)
Lactaat dehydrogenase (0.25 mg/mL, spiertype) (LDH)
α ketoglutaraat (0.25 M) (α-keto)
- 51 -

THEORETISCHE ACHTERGROND VAN ELECTROFORESE EN ISOEN-
ZYMEN
Het principe van electroforese (Biochemistry 6de editie p. 71 – p. 74; 5de
editie p. 83 - 86)
Bij electroforese worden de moleculen onder invloed van een electrisch
veld gescheiden op hun verschil in lading en grootte. De scheiding wordt
in polyacrylamide of in agarose-gels uitgevoerd. Wanneer een molecuul
met een lading z zich in een electrisch veld bevindt met een veldsterkte E,
ondervindt het een kracht. Hierdoor krijgt het molecuul een snelheid v. De
snelheid wordt afgeremd door de wrijving met het oplosmiddel. De wrijving
(f) is weer afhankelijk van de grootte en vorm van het molecuul (r) en viscositeit
van het medium (η), zodat de bewegingssnelheid (v) dus afhangt van de
lading van het molecuul, de wrijvingscoëfficiënt met het oplosmiddel en de
sterkte van het electrisch veld. In een formule uitgedrukt: v = z*E/f. f=6πηr.
Daarnaast moeten de moleculen door de poriën van de gel bewegen. Als
grote of langwerpige moleculen in een electroforese gel vertraagd worden
komt dit omdat ze maar in een paar oriëntaties door de poriën kunnen
diffunderen. Deze moleculen kunnen slechts in de lengterichting van de
moleculen door de poriën en niet dwars. Kleinere moleculen kunnen in meer
oriëntaties door de poriën diffunderen en zullen mede daarom sneller bewegen.
Dit heeft tot gevolg dat grotere moleculen meer zullen worden vertraagd
dan de kleinere moleculen. Gelelectroforese is momenteel de meest
gebruikte techniek voor de analyse van eiwit- en nucleïnezuur preparaten.
Vanwege de grote chemische en mechanische stabiliteit worden polyacrylamide
gels veelvuldig in onderzoekslaboratoria gebruikt. Polyacrylamide
wordt gevormd door een radicaalpolymerisatie van acrylamide. De polyacrylamide
polymeren worden onderling verbonden met behulp van N,N,-methyleen-bisacrylamide.
SDS polyacrylamide gelelectroforese (SDS-PAGE)
Een eiwitpreparaat kan eenvoudig met behulp van SDS-PAGE worden onderzocht
op peptide samenstelling. SDS-PAGE is een afkorting van Sodium
Dodecyl Sulphate PolyAcrylamide GelElectrophoresis. Het eiwitpreparaat
wordt eerst met SDS gedenatureerd. Hierbij dissociëren eiwitcomplexen en
ontvouwen de polypeptideketens zich. Daarna worden de S-S bruggen met
2-mercaptoethanol gereduceerd. Het SDS vormt een complex met polypeptiden
van ongeveer 1.2/1 (gram SDS/gram polypeptide). Hierdoor krijgen de
SDS polypeptide complexen een sterk negatieve lading die de eigen lading
van de polypeptide volledig overschaduwt. De SDS polypeptideketen complexen
krijgen dus bij benadering een uniforme negatieve ladingsdichtheid.
De vorm van SDS-polypeptide complexen blijkt ook nog redelijk regelmatig
te zijn waardoor de migratiesnelheid door een gel alleen afhankelijk is van
het molecuulgewicht van het polypeptide. Deze feiten vormen de achtergrond
van de SDS-PAGE techniek.
Isoelectrisch focusseren
Het principiële verschil tussen isoelectrisch focusseren en electroforese is dat
bij isoelectrisch focusseren de electroforese in een gel met een pH gradiënt
wordt uitgevoerd, terwijl bij de SDS-PAGE of de natieve-PAGE de pH in de gel
vast is. Indien de pH gradiënt in de gel goed gekozen is, zullen de eiwitten bij
isoelectrisch focusseren op basis van hun isoelectrische punten (pI) geschei-
- 52 -

den worden. Dit is als volgt in te zien. De nettolading van een eiwit is net als
dat van de aminozuren waaruit een eiwit is opgebouwd afhankelijk van de
pH. Bij een lage pH zal een eiwit een positieve lading hebben, bij een hoge
pH een negatieve lading. Ergens tussen beide extremen in zal de nettolading
nul zijn. De pH waarbij dit het geval is, noemt men de pI, het isoelectrisch
punt van het eiwit.
In een electrisch veld zal een eiwit afhankelijk van zijn nettolading in de
richting van de anode (+ pool) of in de richting van de kathode (- pool)
bewegen. Wanneer het eiwit in een gel met een pH gradiënt beweegt, zal
de lading van het eiwit met de veranderende pH afnemen. Het eiwit blijft
bewegen totdat het eiwit bij zijn pI waarde is aangekomen en geen nettolading
meer heeft. Zolang de pH gradiënt in de gel stabiel is zal de diffusie die
bij andere chromatografische technieken piekverbreding geeft niet optreden
omdat het eiwit steeds weer terugbeweegt naar de pH waarde van zijn
isoelectrische punt. Deze eigenschap, het concentreren van de moleculen
is uniek voor het isoelectrisch focusseren. De stabiele pH gradiënt in de gel
wordt gevormd door speciale buffers aan de gel toe te voegen, de zogenaamde
amfolieten. Dit zijn alifatische polyamino-polycarboxyl zuren.
Tijdens de electroforese treden er bij de electroden
redoxreacties op. Bij de anode (+ pool) is dit de oxidatie
van H 2 O. De anode wordt zuur. Bij de kathode
(- pool) vindt reductie van H + plaats. De kathode
wordt dus basisch. Deze pH gradiënt zet zich ook in de
gel voort als deze niet sterk gebufferd wordt. Geladen
moleculen (waaronder eiwitten en amfolieten) gaan onder invloed van het
electrisch veld door de gel migreren. De eiwitten vanaf de plaats waar ze zijn
opgebracht en de amfolieten door de gehele gel. De amfolieten bereiken
hun pI veel sneller dan eiwitten omdat de amfolieten die veel kleiner zijn
dan eiwitten sneller diffunderen. Ook kan men voordat de eiwitten opgebracht
worden, de gel met amfolieten prefocusseren. Gezien hun amfolitisch
karakter bufferen de amfolieten de pH lokaal en houden hiermee de door de
electrode reacties veroorzaakte pH gradiënt in stand.
2- Dimensionale electroforese
De combinatie van isoelectrisch focusseren van eiwitten en SDS-PAGE in een
richting loodrecht op de richting van het isoelectrisch focusseren, noemt
men 2-dimensionale electroforese. Het oplossend vermogen van de combinatie
van deze twee electroforese technieken is zeer groot.
Isoenzymen (Biochemistry 6de editie p. 283; 5de editie p. 274 - 275)
Isoenzymen zijn enzymen die verschillen in hun aminozuurvolgorde maar
die wel dezelfde reactie katalyseren. Meestal hebben de isoenzymen verschillende
katalytische eigenschappen zoals verschillen in de KM waarde of
wordt de activiteit op een verschillende manier gereguleerd. Isoenzymen
worden altijd door verschillende genloci gecodeerd. Men neemt aan dat
isoenzymen zijn ontstaan door genduplicatie gevolgd door gendivergentie.
Wanneer een enzym op een zelfde locus op een chromosoom verschilt van
het enzym op het complementaire chromosoom dan spreekt men niet van
isoenzymen maar van genetische verschillen per individu. Bovendien kan
het zo zijn dat er expressie vanaf beide allelen plaatsvindt in heterozygoten.
In dit experiment wordt het isoenzympatroon van fosfoglucomutase be-
- 53 -

studeerd. Dit enzym verbindt het glycogeen metabolisme met het glucose
metabolisme. Er zijn bij de mens 5 loci bekend. In spier weefsel zijn drie
isoenzymen duidelijk aantoonbaar. Twee komen uit spiercellen zelf (een
cytoplasmatische en een ER-membraan gebonden enzym) en een isoenzym
uit rode bloedcellen. Deze drie zijn duidelijk aantoonbaar, maar als langer
gekleurd wordt komen er nog twee spots op de gel bij.
Bovendien kan fosfoglucomutase gefosforyleerd of gedefosforyleerd aanwezig
zijn (fosforylering in spierweefsel vindt plaats via de CaM kinase. Zie
Biochemistry 6de editie, p. 389 – p. 391, 5de editie p. 410 - 411).
Omdat de aminozuursamenstelling door een andere aminozuurvolgorde
verschilt, verschillen isoenzymen in isoelectrisch punt. Via deze eigenschap
kunnen isoenzymen van elkaar gescheiden worden met isoelectrisch focusseren.
HET BEPALEN VAN ISOENZYMEN MET BEHULP VAN ISOELEC-
TRISCH FOCUSSEREN
Doel van het experiment
Het doel van dit experiment is het uitvoeren van een isoelectrisch focussering
experiment en het meten van een enzymactiviteit in een gel. Bovendien
moet de gel worden geïnterpreteerd.
De volgende vleespreparaten die door de assistent zijn gemaakt zullen
onderzocht worden op het isoenzym patroon van het enzym fosfoglucomutase.
1) 100% rundvlees (biefstuk),
2) rundergehakt
3) ‘slavink’
4) 100% varkensvlees (hamlap)
5) 100% rundvlees (hart)
6) 60% hamlap, 20% biefstuk, 20% water
Na een succesvol experiment zou het mogelijk kunnen zijn om met behulp
van het fosfoglucomutase isoenzym patroon een uitspraak te kunnen doen
over de aanwezigheid van rundvlees (spier of hart) en varkensvlees in rundergehakt
en slavinken. Slavinken behoren naast varkensvlees ook rundvlees
te bevatten. Opmerkelijk is dat op de verpakking niet wordt aangegeven of
het runderskeletspier of runderhart betreft.
Het Pharmacia PhastSystem: preparaateisen en gevoeligheid van de
techniek
Op het practicum zal het Pharmacia PhastSystemTM met een PhastGel IEF
5-8 gebruikt gaan worden. Deze prepacked gel van polyacrylamide (5%
acrylamide en 3% crosslinker) en een dikte van 0.35 mm is opgebracht op
een plastic plaat en bevat amfolieten die een scheiding van eiwitten met een
pI van 5 tot 8 mogelijk maakt. Het monstervolume dat per preparaat nodig
is bedraagt 1-6 μL. De zoutconcentratie mag niet hoger zijn dan 0.5 M NaCl
en de bufferconcentratie niet hoger dan 0.05 M. De eiwitconcentratie van
het op te brengen preparaat is afhankelijk van de detectiemethode. Voor
een Coomassie Brilliant Blue (CBB) kleuring moet de eiwitconcentratie per
polypeptideketen minstens 20-30 μg/mL zijn en maximaal 2 mg/mL. Als een
gevoeliger zilverkleuring gebruikt wordt zijn de waarden 1-5 μg/mL en 0.1
mg/mL. In ons geval zal de gel niet op de aanwezigheid van eiwit worden
gekleurd, maar op de aanwezigheid van het enzym fosfoglucomutase.
- 54 -

HANDLEIDING VOOR HET GEBRUIK VAN HET PHARMACIA FASTSY-
STEM VOOR HET ISOELECTRISCH FOCUSSEREN VAN DE WEEFSEL-
PREPARATEN
Het isoelectrisch focusseren telt drie stappen:
• het instellen van de pH gradiënt in de gel,
• het opbrengen van de preparaten
• het focusseren.
Het voltage wordt per stap aangepast (zie onderstaande handleiding Pharmacia
PhastSystemTM). Tijdens het instellen van de pH gradiënt, de pre-focuseringsstap,
kan de sample applicator klaargemaakt worden.
Let op dat je de juiste monsters op de juiste gel brengt.
Voor de PGM (PhosphoGlucoMutase) meting wordt een IEF 5-8 gel en de 6*4
sample applicator gebruikt.
Controle- en uitvoeringsstappen
- Zijn de electrodes en de koelplaat schoongemaakt door de voorganger?
Zo nee maak ze schoon met demiwater. Als het goed is staan de electrodes
in de lage stand.
- Zet het apparaat aan en stel de stand-by temperatuur door het drukken
op de toetsen ‘SEP stand-by temp’ en ‘do’.
- Maak de sample applicator 6*4 klaar. Hiertoe wordt een stuk ParafilmR
op de sample applicator-mal gelegd met het beschermende papier naar
boven. Wrijf nu bijvoorbeeld met een pen of vinger over het beschermde
parafilm zodat er in het parafilm putjes ontstaan. Leg het parafilm op een
vlak en stevig oppervlak en verwijder het beschermende papier.
- Vul de putjes in het parafilm met 6 μL van de te onderzoeken preparaten.
Druk de pipet niet helemaal leeg, dan produceer je geen belletje dat de
capillaire werking van de sample applicator kan verstoren.
- Breng per gel 100 μL water op in het midden van het rood omlijnde gelkoeloppervlak.
- Haal een gel uit de koelkast (een IEF 5-8), let op of de beschermende folie
mee uit het pakket komt of niet. Leg de gels met behulp van een pincet
zonder luchtbellen in te sluiten op het koeloppervlak binnen de rode lijnen.
Let op dat je de plastic onderkant op de plaat legt en niet de gel met
het beschermfolie. Zuig het eventuele overtollige water met papier op.
- Zuig met de sample applicator via de capillaire werking preparaat op (± 4
μL).
- Als laatste stap voor het starten van de electroforese wordt het beschermende
plastic film van de gels gehaald als deze nog aanwezig is
en wordt de electrodehouder voorzichtig op de gels geplaatst. Daarna
wordt de sample applicator in de middelste stand in de houder bevestigd.
De sample applicator mag niet met de hand op de gel geduwd
worden. Dit zal later via het programma automatisch gebeuren.
- Het deksel wordt gesloten en via het intoetsen van: ‘SEP start stop’;
number of gels ‘2’ ingeval van twee gels anders ‘1’ intoetsen; ‘do’; start SEP
method ‘7’ of ‘1’ (apparaatafhankelijk. Let op dat de juiste pH gradiënt in
de display verschijnt), ‘do’ wordt de electroforese gestart.
- De electroforese zal ongeveer 30 min in beslag nemen.
Het programma wordt bij 15 °C uitgevoerd en bestaat uit de volgende stap-
- 55 -

pen:
De pre-focussing
De pre-focussing stap vindt plaats bij ongeveer 2.5 mA (bij het gebruik van
één gel) met een oplopend voltage vanaf ± 200 V naar 750 V totdat 75 Vh
bereikt is. Dit duurt ongeveer 9 min.
Het opbrengen van de preparaten.
De sample applicatorarm gaat programmagestuurd naar beneden en bij een
voltage van 200 V diffundeert het preparaat de gel in. Het totale vermogen
dat gedurende dit traject (ongeveer 4.5 min) door gel wordt gestuurd is 15
Vh.
Het focusseren
Het focusseren vindt plaats bij een constant vermogen van 3.5 W per gel. Dit
wordt bereikt met een amperage van ongeveer 2 mA en een voltage aan het
begin van het experiment van 1400 V. Door een toenemende weerstand in
de gel zal het voltage tijdens het focusseren oplopen. Gemiddeld is het voltage
1650 V. Na ongeveer 15 min is er 410 Vh door de gel gegaan en wordt
het proces gestopt.
Het beëindigen van het focusseren
Door middel van een ‘piep’ wordt aangegeven dat het focusseren is afgelopen.
Hierna blijft een spanning over de gel van ongeveer 100 V gehandhaafd.
Dit om de diffusie van de eiwitten tegen te gaan. Om dit te bereiken is
het amperage ingesteld op 0.1 mA. Om af te sluiten moet op ‘SEP start stop’
gedrukt worden en moet bevestigd worden via het indrukken van ‘do’.
Tijdens het focusseren kan begonnen worden met het maken van de agarose-gel
die gebruikt gaat worden voor de fosfoglucomutase activiteitsmeting.
In situ ACTIVITEITSBEPALING VAN FOSFOGLUCOMUTASE
De weefselspecifieke fosfoglucomutase isoenzymen in de preparaten zijn
met behulp van isoelectrisch focusseren in een gel gescheiden. Dit is uitgevoerd
met het Pharmacia FastSystem in een IEF 5 8 gel. Hieronder wordt de
samenstelling gegeven van het reactiemengsel om de fosfoglucomutase
activiteit van de preparaten in een gel te meten.
Uitvoering
- Tijdens de electroforese wordt een agarose-gel gemaakt waarin de reactanten
voor de activiteitskleuring van fosfoglucomutase zijn opgelost.
- Oplossing 1
Aan 10 mL 0.125 M Tris-HCl buffer pH 7.4 wordt toegevoegd:
- 40 mg glucose 1-fosfaat
- 5 mg NADP +
- 15 μL glucose 6-fosfaat dehydrogenase
- 0.5 mL NBT (nitro blue tetrazolium) (0.5 % oplossing in H 2 O)
- 0.5 mL PMS (phenazine methosulfate) (0.2% oplossing in H 2 O)
- 56 -

- Oplossing 2
Los 0.15 g agarose M op in 10 mL 0.125 M Tris-HCl buffer pH 7.4 door
voorzichtig te verwarmen in vlam in de zuurkast terwijl er voorzichtig
geschud wordt.
- Breng de agarose-oplossing over in een waterbad van 60⁰C en voeg na
enige minuten oplossing 1 toe. Meng beide oplossingen voorzichtig met
behulp van een vortex mixer en giet de oplossing meteen over de hydrofiele
kant van een 6*12 cm GelBond plastic blad. Deze hoeveelheid is
voldoende voor twee gels. Laat de Agarose-gel stollen en bewaar de gel
in het donker.
- Na de electroforese wordt de electroforese gel ondersteboven, dus met
de gelkant en niet het plastickant, voorzichtig op de agarose-gel gelegd.
Probeer het insluiten van luchtbellen te voorkomen.
- De ‘gel-sandwich’ wordt gedurende ongeveer 30 minuten in het donker
gekleurd. Digitaliseer de gel via een foto of een scan. Vraag de assistent je
te helpen.
AH Slavinken, 3 stuks
Prijs per standaard hoeveelheid: € 6.99/KG
Een gekruide gehakt- vulling met daaromheen een dun lapje
varkensvlees, gesneden van de varkensbuik.
• Algemeen: Varkens/rundvleesproduct.
• Ingrediënten: 62% varkensvlees, 18% rundvlees, tarwezetmeel,
paneermeel, plantaardige olie,specerijenextracten, paprika,
zout, peper, azijn,melkeiwit, maltodextrine, smaakversterker
(E621),voedingszuren (citroenzuur, E262, E325), anti-oxidanten
(E301, E331), stabilisator (xanthaangom).
• Bereiden: Koekenpan: verhit boter en/of (olijf)oliein een koekenpan.
Bak de slavinken rondom bruinen op matige temperatuur
in ca. 18 minuten gaar.Regelmatig keren.
• Bewaren: In de koelkast, te consumeren tot de uiterlijk vermelde
datum. Geschikt om in te vriezen op de dag van aankoop,
dan binnen 3 maanden gebruiken. Voor gebruik ontdooien
Slavinkpreparaat en mengsel 62% hamlap en 18
% biefstuk na de eerste centrifugatiestap
Nadat het weefsel (cellen) in een ‘potterbuis’ zijn
stukgewreven worden de oplosbare celcomponenten
gescheiden van de hele cellen, kernen en
extracellulair onoplosbaar materiaal (o.a. bindweefsel).
Het in de slavinken aanwezig harde vet werkt
als een prop die verhindert dat de meniscus zich na
het centrifugeren weer horizontaal kan instellen.
- 57 -

VERSLAG OVER BLOK 3
Urinezuurbepaling
- Geef in het verslag de gevonden waarden van de DDL bepaling en de
zuurstofmetingen. Bereken uit deze getallen de juiste concentratie van de
urinezuurstandaard en de concentratie van urinezuur in de urine. Geef aan
hoe je de berekening uit hebt gevoerd.
- Vergelijk de resultaten van beide bepalingsmethoden. Welke methode
geeft de meest betrouwbare uitkomst?
- De molaire extinctiecoëfficiënt van DDL, ε DDL (410nm) = 8 x 10 3 M -1 .cm -1 .
GOT-GPT metingen
- Geef de reactievergelijking van de door GOT en GPT gekatalyseerde reactie
en geef aan met welke volgreactie de activiteit gedetecteerd wordt.
- Geef in je verslag aan hoe je het aantal units GOT en GPT per liter serum
uit gemeten extinctieveranderingen hebt berekend. (1 unit is die hoeveelheid
enzym die per min 1 μmol product produceert bij 30°C). ε NADH
bij 340 nm = 6.3 mM -1 .cm 1 .
- Geef aan hoe je hebt gecontroleerd dat de gemeten GOT en GPT activiteit
ook echt de activiteit van de GOT en GPT enzymen was en niet die van de
detectie-enzymen.
- Waarom is het zo belangrijk precies bij 30°C de activiteit te meten?
- Bepaal het “DeRitis” quotiënt.
- Welke conclusies kan je trekken uit de GOT en GPT metingen en uit de
waarde van het “DeRitis” quotiënt met betrekking tot een mogelijke
ziekte van de patiënt?
Isoelectrisch focusseren
• Presenteer een scan van de gel.
• Tracht uit de samenstelling van de fosfoglucomutase reactiemix te achterhalen
volgens welke reacties de activiteit van fosfoglucomutase in de
agarose-gel gedetecteerd is. (Info: PMS oxideert NAD(P)H en gereduceerd
PMS reduceert NBT; gereduceerd NBT is niet oplosbaar en slaat neer).
• Beschrijf de uitkomst van het isoelectrisch focuseringsexperiment. Geef
aan hoeveel isoenzymen er in runderspier en varkensspier worden aangetroffen.
• Is het mogelijk met behulp van het fosfoglucomutase isoenzym patroon
een uitspraak te doen over de aanwezigheid van rundvlees en varkensvlees
in het rundergehakt?
• Is de inhoud van het vleesproduct van Albert Heijn (‘slavink’) in overeenstemming
met het label dat op het vleesproduct aanwezig is? (zie vorige
bladzijde) Geef aan of de testmethode goed genoeg geweest is om de
aangegeven samenstelling te kunnen detecteren. Realiseer je dat runderhart
ook rundvlees is en dat glycogeen een belangrijke energiebron
voor spiercontractie is in skeletspier maar niet in hartspier. Hartspier mag
namelijk niet verzuren.
- 58 -

Basispracticum Biologische Chemie: Biochemie-deel
Blok 1 (in silico experimenten):
- gebruik van antilichamen in detectie en analyse van eiwitten en
eiwitcomplexen
- opzetten van een (fluorimetrische) enzymactiviteitsmeting
Blok 2:
- het gebruiken van fluorescentie en lichtabsorptie bij fysiologische
studies (in vivo fluorescentie, ΔG berekeningen)
- het gebruik van computer graphics om het werkingsmechanisme
van enzymen te bestuderen (CG)
Blok3:
- de detectie van (weefselspecifieke) enzymen of substraten voor het
vaststellen van: jicht, een hartaanval of een levercirrose, de
aan/afwezigheid van varkens/rundvlees in slavinken
Blok 1
In silico experimenten: detectie van eiwitten en
eiwit(enzym)compexen
Isolatie en identificatie enzymcomplexen
• Bepalen van de kwaliteit (titer) van een IgG oplossing
• Het uitvoeren van een immunoprecipitatie
• Analyse van het geprecipiteerde eiwitcomplex m.b.v proteomics (een
trypsine digestie van een bandje uit een SDS gel; het bepalen van de
massa’s van de peptides in het digest; het vergelijken van de massa’s met
databases van eiwitten)
Kwantitatieve bepaling van een eiwit
• Het bepalen van een hormoonconcentratie m.b.v. de ELISA methode
Het meten van genexpressie met een reporterenzym
• Opzetten en in silico uitvoeren van een fluorimetrische
enzymactiviteitsmeting (ß-glucuronidase in een transgene plant)
Structuur IgG molecuul
Het Fc-domein is de bindingsplaats voor protein A of anti-IgG
(konijn) opgewekt in een geit
PowerPoint paginanummer 1

Monoclonale en polyclonale antilichamen
• Het antigeen bevat delen (epitoop)
waaraan de antilichamen (IgG’s)
binden.
• Een polyclonaal antilichaampreparaat
bevat meerdere verschillende IgG
moleculen die elk aan verschillende
epitopen binden.
• Een monoclonaal antilichaam
preparaat bevat identieke IgG
moleculen.
• De bindingsaffiniteit aan een epitoop
verschilt per IgG molecuul.
Het karakteriseren van de bindingsaffiniteit
[ Ag]
x[
Ab]
Ag-Ab Ag + Ab KD
=
[ Ag−
Ab]
• K D = dissociatie constante, wordt gebruikt om de
bindingsaffiniteit te karakteriseren. Een lage K D, geeft aan dat
het ligand een hoge bindingsaffiniteit heeft voor het eiwit.
• K D varieert tussen 10 -12 en 10 -8 M
• Als 50 % van de bindingsites bezet is ([Ab] ~ [Ag-Ab]) dan is
vrij [Ag] gelijk aan de K D, dus tussen 10 -12 en 10 -8 M
Ag = antigeen (GFP)
Ab = antibody = IgG
Immunoprecipitatie methode
Ag Ab Ag Ab
(protein A) (protein A)
beads
beads
ELISA methode
Avidine-enzym
Ag Ag-biotine
Ab Ab
polystryreen
Gelabeld antigeen wordt verdrongen van een beperkte aantal bindingsplaatsen door
ongelabeld antigeen. De bindingsplaatsen zijn gekoppeld aan een vaste drager.
PowerPoint paginanummer 2

Immunoprecipitatie en proteomics
Stap 1: bepaal het percentage (titer) GFP bindende IgG moleculen
van een IgG preparaat
• incubeer een oplopende concentratie GFP met een vaste
hoeveelheid IgG.
• verwijder IgG uit de oplossing
• meet de in het supernatant achterblijvende concentratie GFP met
behulp van fluorescentie
Experimentele restricties
• Altijd IgG dat geen antigeen bindt. Titer varieert, maar moet
beter zijn dan 1%.
• IgG wordt via protein A aan agarose-bolletjes gekoppeld die
vervolgens mbv een centrifuge worden afgedraaid. Beperkte
bindingscapaciteit via protein A. 1 µg IgG kan per incubatie
worden gebonden.
Immunoprecipitatie en peptide identificatie
• Mbv een goed IgG preparaat wordt een GFP-getagd
complex geprecipiteerd
• Ontkoppel complex van IgG en scheidt de peptiden m.b.v
SDS-PAGE
• Extraheer een bandje uit de SDS gel en knip de
polypeptideketen met trypsine
• Bepaal de massa van de trypsinefragmenten met behulp
van MALDI-TOF massa spectrometrie
• Vergelijk de dataset van de massa’s met databases en
identificeer de polypeptide keten en vervolgens het
geprecipiteerde eiwitcomplex
HRP
SA
A B
A A
Elisa test
HRP
SA
A B
HRP
SA
A B
A B
Y Y Y Y Y
polystyreen
Y= IgG; A = antigeen; B = biotine; SA = strepavidine
• Variabele titer IgG per experiment.
HRP
SA
•Verdringing van gelabeld antigeen door ongelabeld antigeen
•Label wordt via een enzymactiviteitsmeting zichtbaar gemaakt
PowerPoint paginanummer 3

ß-glucuronidase als reporter enzym
• Het E. coli ß-glucuronidase gen als reporter om
gen expressie aan te tonen
• De ß-glucuronidase activiteit in de verschillende
planten is een maatstaf voor gen-expressie
• De reactie die door GUS wordt gekatalyseerd
V 0 is de initiële snelheid
Fluorescent
[ S]
•V
V0
=
([ S]
+ K
MAX
Door bij een vaste hoeveelheid enzym bij verschillende
substraat concentratie de activiteit te meten krijg je een V 0
tegen S plot.
De ß-glucuronidase activiteit (vakjes / min) in een plantenextract bij drie
verschillende hoeveelheden plantmateriaal onder VMAX-condities: S = 10 x KM [ S]
•V
[ 10K
M ] •VMAX
10•V
MAX 0.
91•V
MAX V =
= = MAX
V0
=
0
([ S]
+ K ) ([ 10K
M ] + K M ) 11
M
10, 5 en 15 µl bladextract
M
)
PowerPoint paginanummer 4

De ijking van de fluorimeter met 10 µl MUB van 100 µM
Volume meting 1: 1.01 ml
Volume meting 2: 1.02 ml
5 µl bladextract 40 sd
Hoe bereken je de concentratie MUB in
10 µl bladextract 36 sd
het cuvet door het toevoegen van 10 µl
MUB van 100 µM aan een cuvet met
1.00 ml inhoud en daarna nog een tweede
toevoeging MUB?
(0.01 mL/1.01 mL) * 100 µM = 1.01 µM
(0.01 mL/1.02 mL) * 100 µM = 0.98 µM
Blok 2: - het gebruiken van fluorescentie bij fysiologische studies
- het gebruik van computer graphics om het werkingsmechanisme
van enzymen te bestuderen
•Absorptie en fluorescentie
•Regulatie van de glycolyse in gistcellen
•Lactaat dehydrogenase: activiteitsmeting, instellen van chemisch
evenwicht (ΔG berekeningen), bindingsstudie en computer graphics
I 0
I m
Strooilichtfilter
Foto
multi
plier
Absorptiemeting
Bij een absorptiemeting meet je
altijd hoeveel licht er na het cuvet
nog over is.
Een absorptiemeting is een meting
ten opzichte van een blanco. Deze
meting levert een waarde I bl op.
De hoeveelheid licht van de meting
van de blanco wordt vergeleken met
de hoeveelheid licht die op de
fotomultiplier valt bij de meting van
het monster (I m

Evenredigheid van lichtabsorptie met de concentratie
Lichtabsorptie: wet van Lambert-Beer
De afname van de lichtintensiteit ergens in het cuvet is rechtevenredig met de intensiteit
ter plaatse:
-dI/dl = k*I
en deze afname is rechtevenredig met de concentratie van de absorberende stof.
-dI/dl = k*c*I.
Als deze formule (dI/I = -k*c* dl) geïntegreerd wordt vanaf lichtweglengte 0 tot 1 cm en
een lichtintensiteit vooraan in het cuvet van I0 en overgegaan wordt van elog naar 10log dan
wordt de formule:
I = I0 *10- ε*c*1
log(I/I0)= log (10- ε*c )
log I0 /I = logI0 - logI = ε*c = E
E = ε*c is de wet van Lambert-Beer en deze wet geeft aan dat de logI0 - logI
(lichtabsorptie) rechtevenredig is met het concentratie van de absorberende
stof. Een spectrofotometer zet I via een –logI conversie op de display.
De
intensiteit
neemt af
volgens:
I=I 0 *10 -ε*c*l
Lichtabsorptie en de daaraan gekoppelde fluorescentie
1
NADH absorbeert licht bij 340 nm,
NAD + niet
Relation absorption - fluorescence
Effect of light absorbance by NADH on the
intensity of the light beam in a cuvette
0.8 0.6 0.4 0.2
distance in the cuvette (cm)
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0
Relative intensity
0.1 mM
De fluorescentie is
een fractie van het
geabsorbeerde licht.
De lichtabsorptie is
weer een fractie van
de lichtintensiteit ter
plekke.
PowerPoint paginanummer 6

Fluorescence (AU)
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Concentration dependency of fluorescence and absorbance
0 0.05 0.1 0.15 0.2
0
0.25
Concentration (mM)
De relatie fluorescentie-concentratie is:
fluorescentie = factor *( 1-e (-k*c) ) = factor *( 1-10 (-ε*c) ) = factor *( 1-10 (-Abs) )
De relatie absorptie-concentratie is: absorptie = ε * c
NADH fluorescentie
In vivo fluorescentie
Wat gebeurt er in de verschillende fases (1-6)?
Tijd
Glycolyse in gistcellen
Afhankelijk van de beschikbaarheid van zuurstof wordt CO 2
of ethanol gevormd.
De achterliggende fysiologische regulatie zal na afloop van
het experiment aan de hand van de verkregen resultaten
behandeld worden.
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
Absorbance
PowerPoint paginanummer 7

Het werkingsmechanisme van een enzym:
lactaat dehydrogenase
• Het meten van de activiteit met pyruvaat en oxamaat.
Oxamaat is een structuur analoog van pyruvaat maar kan
niet door NADH worden gereduceerd.
• Het laten instellen van het chemisch evenwicht van de
reductie van pyruvaat door NADH of de oxidatie van
lactaat door NAD + . Hierdoor zijn ΔG berekeningen
mogelijk.
• Het meten van de bindingsaffiniteit van NADH en het
effect van oxamaat.
• Het bestuderen van de structuur van het enzym met en
zonder gebonden 'substraten' (NADH en oxamaat).
Pyruvaat + NADH + H
LDH
+ NAD + + Lactaat
Absorbeert bij 340 nm
Overdracht van een H - en de opname van een H +
Pyruvaat
Oxamaat
H -
Absorbeert bij 280 nm
Absorbeert bij 280 nm
Lactaat
H +
PowerPoint paginanummer 8

Vrije energie berekeningen (ΔGº)
Pyruvaat + NADH + H
LDH
+ NAD + + Lactaat
+
([ lactaat]
x[
NAD ])
ΔG
= ΔGº
+ RT ln
([ pyruvaat]
x[
NADH )
•In evenwicht is ΔG = 0.
•Als nu de concentraties van de reactanten berekend
worden is de ΔGº te berekenen
Blok 3
Klinisch chemische experimenten: de detectie van moleculen en
(weefselspecifieke) enzymen voor diagnostische doeleinden
• jicht (urinezuurbepaling)
• hartaanval/levercirrose (GOT/GPT)
• detectie van weefsel specifieke isoenzympatroon met
behulp van isoelectrisch focusseren
Natriumuraat kristallen.
Gewrichten en nieren worden door
deze kristallen beschadigd.
Urinezuurbepaling
Jicht: kristallen van natriumuraat veroorzaken gewrichtsontstekingen,
te beginnen in de grote teen
PowerPoint paginanummer 9

De vorming van urinezuur
pH~7
Het oplosbaarheidsproduct van natrium-uraat is pH afhankelijk. Bij pH
7.2, 37º C en 150 mM Na + is slechts 0.45 mM uraat oplosbaar.
Slecht oplosbaar
Goed oplosbaar
Uricase
De vorming van allantoine
pKa urinezuur = 5.8
Een gekoppelde meting
Glutamaat Pyruvaat Transaminase (GPT)
α-ketoglutaraat + alanine glutamaat + pyruvaat
pyruvaat + NADH lactaat + NAD +
LDH
• De activiteit van GPT moet
snelheidbeperkend zijn.
• De activiteit van lactaat
dehydrogenase moet hoog zijn.
• De activiteit van GPT kan gemeten
worden door de afname van de
absorptie bij 340 nm ([NADH] in
de tijd te volgen.
PowerPoint paginanummer 10

GOT is een gekoppelde meting
Glutamaat Oxaloacetaat Transaminase
α-ketoglutaraat + aspartaat glutamaat + oxaloacetaat
oxaloacetaat + NADH malaat + NAD +
MDH
De activiteit kan gevolgd worden door de afname van de
[NADH] in de tijd bij 340 nm te volgen
• Bij een hartaanval gaan er cellen dood en de oplosbare
enzymen komen in het bloed terecht. Relatief veel GOT in
hartcellen.
• In levercellen zit meer GPT dan GOT.
Electroforese:
bewegen van eiwitten in een electrisch veld,
afhankelijk van hun nettolading
+
Bij SDS electroforese wordt SDS (sodium dodecyl-sulfaat)
toegevoegd aan eiwitten. Door binding van SDS ontvouwen
eiwitten (polypeptideketens). SDS is negatief geladen en per
lengte eenheid is er nu evenveel lading. De electrische kracht
wordt evenredig met de lengte.
O-SO 3 -
O-SO 3 -
O-SO 3 -
O-SO 3 -
Zonder SDS beweegt het eiwit afhankelijk van zijn
natuurlijke lading en die wordt bepaald door de pH.
O-SO 3 -
O-SO 3 -
O-SO 3 -
-
O-SO 3 -
PowerPoint paginanummer 11

SDS electroforese
SDS ontvouwt eiwitten en geeft de peptideketens een min
of meer gelijke (negatieve) ladingsdichtheid per lengte
eenheid: scheiding op grootte
SDS electroforese scheidt gedenatureerde peptideketens op grootte
De lading van eiwitten wordt bepaald
door de eigenschappen van de
aminozuurresiduen: begrip pK a en pI
Totale lading
+ ± -
PowerPoint paginanummer 12

Anode (+) pool
Low pH
(+)
Low pH
(+)
pH laag
De pI is de pH waarbij het eiwitmolecuul
geen netto lading heeft.
pH hoog
Start van het experiment
Eind van het experiment
Isoenzympatronen
Kathode (-) pool
High pH
(-)
High pH
(-)
• Isoenzymen zijn enzymen die dezelfde reactie katalyseren maar een
iets andere aminozuurvolgorde hebben. Hierdoor verschillen
isoenzymen in activiteit en in lading (pI).
• De aminozuursamenstelling van een enzym verschilt ook per
organisme. Dit geeft ook een andere pI.
• Samen geven ze een weefsel en organisme specifiek
isoenzympatroon
PowerPoint paginanummer 13

IEF-experiment
• Vleesextracten opbrengen.
• Eiwitten en dus ook isoenzymen scheiden op basis van hun pI.
Detecteren op basis van activiteit.
• Hier testen van de PGM activiteit.
• Het isoenzympatroon is karakteristiek voor vleessoorten (organismeen
weefselspecifiek).
Plaats phosphoglucomutase
in het
glycogeen metabolisme
PowerPoint paginanummer 14