colleges 3 en 4 - Biochemistry

Hoofdstuk 2: “Protein structure and function”
Kristallen van humaan insuline
(een eiwithormoon)

Onderwerpen
• Eiwitten zijn lineaire polymeren die opgebouwd zijn uit 20 verschillende
aminozuren
• De primaire, secondaire, tertiaire en quaternaire structuur van een eiwit
• De aminozuurvolgorde van een eiwit bepaalt haar driedimensionale
structuur en daarmee ook haar functie (katalyse, transport van bijvoorbeeld
O 2 , mechanische sterkte, immuunbescherming, beweging, transmissie van
zenuwimpulsen, controle van groei en differentiatie, ....)

Eiwitten zijn opgebouwd uit een repertoire van 20 aminozuren
(4)
(3)
(1) (2)
• Algemene naamgeving en stereo-isomeren van aminozuren: centraal
koolstofatoom (C α ), amino-groep (NH 3 + ), carboxylgroep (COO - ) en
restgroep (R)
• Aminozuren zijn chiraal; in eiwitten zijn alleen L-aminozuren ingebouwd

• Grootte
• Vorm
• Lading
De zijketens van de 20 aminozuren verschillen in:
• De mogelijkheid tot het vormen van een waterstofbrug
• Hydrofoob karakter
• Chemische reactiviteit

De ionisatietoestand van aminozuren als functie van de pH

Indeling aminozuren op basis van de chemische eigenschappen
van hun zijketens
• Alifatisch: (Gly), Ala, Val, Leu, Ile, Met
• Cyclisch: Pro
• Aromatisch: Phe, Trp
• Alifatische hydroxylgroep: Ser, Thr
• Aromatische hydroxylgroep: Tyr
• Carboxamide: Asn, Gln
• Sulfhydrylgroep: Cys
• Basische groep: Lys, Arg, His
• Carboxylgroep: Asp, Glu
Hydrofoob met niet-polaire zijketens
Polair (maar ongeladen)/hydrofiel
Positief geladen/hydrofiel
Negatief geladen/hydrofiel

Makkelijk ioniseerbare groepen in eiwitten
Table 2.1

• Alifatisch
• Aromatisch
• Hydrofobiciteit
• Hydrofiel
• Waterstofbrugvorming
• Alifatische hydroxylgroep
• Sulhydrylgroep
• Zure groep
• Basische groep
Begrippen die je dient te kennen:
Aminozuren werden al miljarden jaren
geleden gevormd
(voordat leven ontstond)
De veelzijdigheid aan eigenschappen
maken de 20 gebruikte aminozuren
geschikt als bouwstenen voor functioneel
diverse eiwitten, die het verloop van vele
biologische processen mogelijk maken

Aminozuren die ongeschikt zijn voor eiwitten
• Homoserine (en homocysteine) zijn waarschijnlijk in de evolutie
uitgesloten geraakt omdat de bijbehorende zijketens ongewenste
nevenreacties geven die de functionaliteit van eiwitten beperken
• Deze nevenreacties treden niet op bij gebruik van serine (en cysteine)

De primaire structuur van een eiwit is de volgorde waarin
aminozuren via peptidebindingen aan elkaar gekoppeld zijn
• Een peptidebinding is kinetisch zeer stabiel (levensduur ±1000 jaar), maar
het bovenstaande evenwicht ligt aan de kant van de vrije aminozuren
(thermodynamisch labiel). Om de vorming van een peptidebinding toch
mogelijk te maken vereist ‘input’ van vrije energie.
• Een peptidebinding wordt gevormd binnen het ribosoom door gebruik te
maken van geactiveerde aminozuren (die zijn gebonden aan een tRNAmolecuul)
• Aminozuren worden geactiveerd door de activatiereactie te koppelen aan
de hydrolyse van ATP (tot AMP en 2P i )

Activatie van aminozuren en vorming van peptidebindingen
Aminoacyl-tRNA synthetase:
Aminozuur + ATP aminoacyl-AMP + PPi Aminoacyl-AMP + tRNA aminoacyl-tRNA+ AMP
PP i + H 2 O 2 P i
Aminozuur + ATP + tRNA + H 2 O aminoacyl-tRNA + AMP + 2P i
In het ribosoom:

Een polypeptideketen heeft polariteit
peptide-
binding
Leu-enkefaline: een opioïde dat de waarneming van pijn en emoties moduleert

Een polypeptideketen heeft een ruggengraat en zijketens
R 1 -R 5 : zijketens
: peptidebinding
Elk eiwit heeft een unieke en precies gedefinieerde aminozuursequentie

De (reversibele) vorming van een cystine koppelt delen van een
polypeptideketen covalent aan elkaar
O2 + 2H + + 2e- H2O2 Zuurstof oxideert cysteines
tot cystines
Ribonuclease bevat vier cystines

Polypeptideketens zijn flexibel, maar niet alle conformaties zijn
mogelijk
Door haar dubbele bindingskarakter is de peptidebinding vlak. Deze
eigenschap beperkt het aantal mogelijke conformaties van de eiwitruggengraat.

De cis- en transconformatie van een peptidebinding
Om sterische hindering te voorkomen zijn bijna alle peptide-bindingen in eiwitten
in de transvorm

De cis- en transconformatie van een peptidebinding
Proline
In het geval van X-Pro peptidebindingen komen cis-conformaties vaak voor,
omdat er zowel bij de trans- als bij de cisvorm sprake is van sterische hinder

De driedimensionale structuur van een polypeptideketen kan
beschreven worden middels de hoeken φ (phi) en ψ (psi) rond
het C α -atoom van elk aminozuur
α α
φ ψ φ ψ
α
Ten gevolge van het enkelvoudige bindingskarakter van de binding tussen N
en C α , en van de binding tussen C α en C=O, is er vrijheid van rotatie rond deze
bindingen (gespecificeerd door ϕ en ψ, respectievelijk)

Secundaire structuurelementen binnen eiwitten
Een polypeptideketen vouwt zich op na haar synthese. In een apolaire
micro-omgeving gebeurd dit opvouwen dusdanig dat de hydrofobe
zijgroepen zich in het binnenste van een eiwit bevinden (het hydrofobe
effect) en dat er zich er tussen de amino- en carboxylgroepen van een
polypeptideketen zoveel mogelijk waterstofbruggen vormen, waarbij
regelmatige, goed gepakte (van der Waals interactie), structuren ontstaan:
• α-helices
• β-sheets
• β-turns en loops
Specifieke aminozuurvolgordes geven aanleiding tot de vorming van:
• α-helixachtige coiled coil
• collageen triple helix

4
1
5
3
2
De α-helix
Per aminozuur een stijging van 1.5 Å langs de helix-as en een draaiing van
100 graden. Gevolg: per 3.6 aminozuur 360 graden gedraaid en 5.4 Å
gestegen langs de helix-as.

De β-sheet
De afstand tussen aminozuren langs de as van de keten van een β-streng is
±3.5 Å in plaats van 1.5 Å zoals geobserveerd voor een α-helix
Een antiparallelle β-sheet Een parallelle β-sheet

“Reverse turn”
“Reverse turns” en “loops”
“Loops” op het oppervlak van een
deel van een antilichaammolecuul
(loops zijn uitgebreider dan “reverse turns”)
“Reverse turns” en “loops” bevinden zich altijd aan het oppervlak van eiwitten
en spelen een rol bij interacties met andere eiwitten en moleculen

Vezelachtige eiwitten geven structurele ondersteuning aan cellen
en weefsels: α-keratine
“α-helical coiled coil”
“heptad repeat”
• α-keratine is een voorbeeld van een “α-helical coiled coil” eiwit, waarbij twee αhelices
om elkaar heen gewikkeld zijn
• De helices interacteren via ionogene, van der Waals en hydrofobe interacties
• Het gevolg is dat per volledige draaiing van elk der helices je 3.5
aminozuurresiduen opschuift in plaats van 3.6, zoals bij de normale α-helix
• Keratine heeft een 7-residue “heptad repeat”, die specifieke interacties tussen de
α-helices mogelijk maakt
• De α-helices kunnen via disulfidebruggen gekoppeld worden (haren en wol
(flexibel): weinig disulfides; horens, hoeven, klauwen (star): veel disulfides)

Vezelachtige eiwitten geven structurele ondersteuning aan
cellen en weefsels: collageen
13
• Collageen bevat veel glycine, proline en hydroxyproline (Hyp). Elk derde
aminozuur is een glycine.
• Collageen is het meest voorkomende eiwit in zoogdieren (huid, botten,
pezen, kraakbeen, tanden) en heeft een “triple helix” structuur

Structuur van collageen
• Door sterische hinder tussen de (hydroxy)prolines vouwt de polypeptide-keten
zich op tot een helixstructuur
• Er zijn geen waterstofbruggen binnen de polypeptideketen zelf
• Drie strengen draaien om elkaar en vormen zo een superhelixkabel die
gestabiliseerd wordt door waterstofbruggen tussen de ketens
• De hydroxylgroep van hydroxyproline maakt extra waterstofbruggen mogelijk,
die essentieel voor de sterkte van collageen zijn (afwezigheid à scheurbuik)

In water oplosbare eiwitten vouwen zich op tot compacte
structuren met een hydrofobe kern
Modellen voor de driedimensionale structuur van myoglobine
(O 2 -transport in spieren; vereist aanwezigheid van een heemgroep in het eiwit;
het eerste eiwit waarvan de 3D-structuur is opgehelderd (1958))

De verdeling van aminozuurresiduen in myoglobine
Ruimte vullend model: hydrofobe
(geel), geladen (blauw) en andere
(wit) aminozuurresiduen
Dwarsdoorsnede: hydrofobe
residuen zitten aan de
binnenkant

Sommige membraaneiwitten vormen uitzonderingen op de
regel: “hydrofobe zijketens zijn opgeborgen in het inwendige
van een eiwit en hydrofiele zijketens bevinden zich aan het
oppervlak”
De binnenstebuiten aminozuurresiduenverdeling in porine

Motieven en domeinen
Het CD4 eiwit bestaat uit vier gelijke
domeinen
• Bepaalde combinaties van secundaire structuurelementen worden veel gevonden
en vervullen vaak dezelfde functies (bijvoorbeeld het helix-turn-helix motief, dat
in verschillende DNA-bindende eiwitten wordt gevonden)
• Compact gevouwen globulaire eenheden die verschillende malen voorkomen in
een eiwit (verbonden door bijvoorbeeld flexibele polypeptides) worden domeinen
genoemd (bijvoorbeeld te vinden in het celoppervlakte-eiwit CD4)

Quaternaire structuur: ruimtelijke organisatie van meerdere
polypeptideketens die geassembleerd zijn tot een
multisubunitstructuur
Voorbeeld: het Cro eiwit van bacteriofaag λ is een dimeer van identieke
subeenheden met een tweevoudige symmetrie

Quaternaire structuren
Hemoglobine is een α 2 ß 2 tetrameer De mantel van het humane
rhinovirus (à verkoudheid) bestaat
uit 60 kopieën van elk van de vier
subeenheden (α 60 β 60 γ 60 δ 60 )

A! K! I!
G!
L! F! F!
G!
Eiwitvouwing
S! N!
T! G! K! T!
?!
• Hoe verkrijgt een eiwit haar ingewikkelde driedimensionale structuur?
• Wat is de relatie tussen de 1-dimensionale aminozuurvolgorde en de 3dimensionale
structuur van een eiwit?

Eiwitten kunnen in vitro ontvouwen worden
ontvouwingsmiddelen
β-mercapto-ethanol
Eiwitten kunnen ontvouwen worden door gebruik te maken van:
- ontvouwingsmiddelen (zoals ureum en guanidiniumchloride): die niet
covalente interacties in eiwitten verbreken
- en β-mercapto-ethanol: wanneer disulfidebruggen verbroken dienen te
worden

Reductie en denaturatie van ribonuclease
• Eiwitontvouwing kan je volgen met spectroscopische (bijvoorbeeld tryptofaanfluorescentie,
circulair dichroïsme) of fysische (bijvoorbeeld toename in
viscositeit, calorimetrie) methodes
• Nadat een eiwit met 8 M ureum en β-mercapto-ethanol is ontvouwen is haar
enzymactiviteit verdwenen

Kan een gedenatureerd eiwit weer terugvouwen naar haar goed
gevouwen 3D-structuur?
• Verwijdering van ureum en β-mercapto-ethanol, terwijl oxidatie aan de lucht
plaats vindt van de gereduceerde SH-groepen, resulteerde in de spontane
hervouwing van ribonuclease (en andere enzymen) naar de actieve goed
gevouwen toestand (Nobelprijs in de Chemie 1972: Chris Anfinsen)
• De informatie die codeert voor het vouwen naar de natieve, actieve structuur ligt
dus opgeslagen in de aminozuurvolgorde van een eiwit
Centraal dogma in de Biochemie:
de aminozuurvolgorde bepaalt de conformatie van een eiwit

Verkeerde disulfidebruggen kunnen gevormd worden tijdens
eiwitvouwing
• Wanneer ontvouwen ribonuclease geoxideerd
wordt voor verwijdering van ureum,
krijg je na vouwing slechts 1% van de
originele activiteit, omdat maar 1% van de
eiwitmoleculen natief geworden is. De
andere moleculen kunnen geen natieve
structuur krijgen, omdat ze verkeerd
gevormde disulfidebruggen bevatten.
• Toevoegen van een spoortje β-mercaptoethanol
katalyseert her rangschikking van
disulfidebruggen. Gevolg: eiwitmoleculen
met oorspronkelijk verkeerd gevormde
disulfidebruggen hervouwen langzaam naar
hun natieve, actieve toestand. Hervouwen
gebeurd omdat de natieve toestand de
hoogste stabiliteit heeft

Eiwitvouwing wordt gedreven door een afname in vrije energie
• Gevouwen eiwitten hebben een lagere vrije energie G (zijn meer stabiel) in de
afwezigheid van ontvouwingsmiddelen dan ontvouwen eiwitten
• Het verschil in vrije energie tussen de gevouwen en ontvouwen toestand van een
eiwit is klein (ongeveer 5 – 10 kcal . mol -1 ; dat komt overeen met de energie die
vrijkomt bij vorming van 5 tot 10 waterstofbruggen)
• Ten gevolge van hun relatief lage stabiliteit zijn eiwitten flexibel; deze
flexibiliteit is vereist voor de activiteiten van eiwitten (bijvoorbeeld katalyse)